研究AZD9291奥希替尼获得性耐药的机制

　　为了研究对第三代EGFR-TKI 奥希替尼（AZD9291）获得性耐药的机制，我们使用具有T790M突变的EGFR突变NSCLC细胞建立了奥希替尼耐药细胞。要生成T790M突变阳性细胞，即表达EGFR的NSCLC细胞系PC9细胞第六个外显子19缺失突变（ΔE746-A750）连续暴露于第一代EGFR-TKI吉非替尼超过六个月，并分离出克隆耐药细胞。这些抗性细胞表现出T790M突变的存在，因此被命名为PC9 / T790M。在六个月内（按照剂量递增方法）将奥马替尼的浓度从150 nmol / L逐步提高到1μmol/ L来培养PC9 / T790M细胞，从而获得具有T790M突变的耐奥希替尼的细胞，被称为PC9 / T790M / AZDR。我们还从表达EGFR的NSCLC细胞系H1975建立了抗奥希替尼的细胞L858R / T790M突变，使用高浓度方法。将H1975细胞与1μmol/ L的奥希替尼培养3个月，并将获得的耐药细胞命名为H1975 / AZDR。

　　PC9 / T790M细胞对奥希替尼敏感。但是，PC9 / T790M / AZDR细胞对奥希替尼具有高度耐药性，对奥希替尼获得的50％抑制剂量（IC50）比PC9 / T790M细胞高约30倍。PC9 / T790M / AZDR细胞与吉非替尼具有交叉耐药性。在H1975 / AZDR细胞也具有很高的耐奥希替尼。

　　建立耐奥希替尼的PC9细胞。用指示浓度的奥希替尼的处理PC9亲本，PC9 / T790M和PC9 / T790M / AZDR细胞72小时或不进行处理。对奥希替尼的敏感性通过WST-8测定法确定。每个数据点代表六个样品的平均值，并表示为存活细胞相对于未处理对照的百分比。条形图显示了奥希替尼对细胞的IC50值。（c将细胞不处理或用指定浓度的奥希替尼处理三小时。对细胞裂解液进行蛋白质印迹分析，以检测总和磷酸化的EGFR（Y-1068），Akt，ERK1 / 2和肌动蛋白。结果代表两个独立的实验。PC9，PC9 / T790M和PC9 / T790M / AZDR。

　　接下来，我们在不存在或存在奥希替尼的情况下检查了EGFR相关分子的状态。细胞要么未经处理，要么用浓度增加的奥希替尼（0.1-1μmol/ L）处理3小时。处理后，裂解细胞，并进行蛋白质印迹分析。用奥希替尼治疗可抑制PC9亲本PC9 / T790M和PC9 / T790M / AZDR细胞中的EGFR磷酸化水平，但磷酸化AKT的水平在PC9 / T790M / AZDR细胞中未受到抑制。通过奥希替尼治疗，PC9 / T790M / AZDR细胞中的ERK1 / 2磷酸化得到部分抑制。奥希替尼现在的效果还是非常的不错，如果您有需要购买仿制药版本的奥希替尼可咨询下方微信。