ATC细胞系C643、8305C和8505C分别由关海霞博士和雷磊博士提供。将细胞常规地在具有10％胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中于37°C培养。在一些实验中，用乐伐替尼（乐卫玛）和紫杉醇以指定的浓度和时间处理细胞。乐伐替尼和紫杉醇分别购自Selleck Chemicals，LLC。将药物溶解在二甲亚砜中，等分保存在-80°C下直至进一步使用。相同体积的DMSO用作车辆对照。
细胞增殖测定，将细胞（2000 /孔）接种到96孔板中，并用各种浓度的乐伐替尼或紫杉醇培养48小时。接下来，进行3-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定以评估细胞增殖。在指定的时间点进行药物处理后，将10μL的5 mg / mL MTT添加到培养基中，孵育4小时；然后加入150μLDMSO，再孵育15分钟。然后在微板读取器上使用570 nm的测试波长和670 nm的参考波长读取板。对每个数据点进行三次重复。菌落形成试验，使用单层培养进行菌落形成测定。将细胞（4000 /孔）接种到12孔板中，并单独或组合用所示浓度的乐伐替尼和紫杉醇进行培养。每2天刷新一次培养基。培养14天后，将存活的菌落用甲醇固定并用0.5％结晶紫染色，然后对菌落计数。每个实验重复三次。
细胞周期分析，将处于指数生长期的8305C细胞血清饥饿12小时。与5 μM 乐伐替尼和500 nM紫杉醇分别或组合共培养48小时后，收集细胞，在PBS中洗涤两次，并在冰上的70％乙醇中固定至少30分钟。然后将细胞用碘化丙啶（PI）溶液染色。使用流式细胞仪基于DNA含量分析细胞周期。
用指示浓度的乐伐替尼和紫杉醇分别或联合处理C643和8505C细胞72小时。然后收获细胞，用PBS洗涤，并根据制造商的方案通过流式细胞仪用膜联蛋白V-FITC/PI检测试剂盒进行顺序染色。早期凋亡细胞显示膜联蛋白V-FITC + / PI-染色模式，而晚期凋亡细胞显示膜联蛋白V-FITC+/PI+染色模式。它们被统称为凋亡细胞。每个实验重复三次。
裸鼠异种移植肿瘤测定，雌性无胸腺裸鼠购自SLAC实验室动物有限公司，并饲养在特定的无病原体（SPF）环境中。在5周龄时将C643细胞（3×106）皮下注射到小鼠的腹侧。当肿瘤长到约5 mm时，将小鼠分为四组，并进行以下治疗：媒介物对照，腹膜内注射紫杉醇5 mg/kg，5mg /kg/乐伐替尼通过口服途径与这两种药物合用。在治疗过程中每两天测量一次肿瘤体积，并通过公式（宽度）2×长度/ 2计算。治疗12天后，收获肿瘤并称重。
将肿瘤组织包埋在石蜡中，切成4μm切片，并用苏木精和曙红（H＆E）染色。通过Ki-67染色的定量评估细胞增殖能力。简而言之，将抗人Ki-67抗体以1：150稀释，并使用DAB Substrate Kit据标准方案进行免疫染色。通过目测5个随机选择的视野（×200放大倍数），对至少1000个Ki-67阳性细胞进行了评分。如前所述，为了评估不同处理对动物肝细胞的影响，我们对肝脏切片进行了H＆E染色，并通过分光光度法分析了血清中的天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶（ALT）的水平。如果您有需要购买仿制药乐伐替尼？更多详情可咨询下方微信。
请简单描述您的疾病情况，我们会有专业的医学博士免费为您解答问题（24小时内进行电话回访）