虽然各种机制负责EGFR TKI的阻力，涉及到的第三代EGFR TKI OSI的抗性机理的研究是罕见的和不明确的。在这里，NCI-H1975 / OSIR细胞比NCI-H1975细胞表现出更低的EGFR磷酸化和总表达。此外，在奥希替尼（AZD9291）细胞中EGFR的mRNA表达仅是在NCI-H1975细胞中的0.49倍。ERK和AKT是EGFR途径的两个主要下游蛋白，抑制EGFR途径可以降低ERK和AKT的磷酸化。在这项研究中，奥希替尼在NCI-H1975细胞中显着抑制ERK和AKT的磷酸化，而在NCI-H1975 / 奥希替尼R细胞中则没有。可以得出结论，EGFR表达的下调可能有助于NCI-H1975/奥希替尼R细胞中奥希替尼的耐药性。
据报道，EGFR在细胞中的表达降低是对BH3模仿的navitoclax的敏感性。因此，研究了navitoclax处理后NCI-H1975和NCI-H1975 / 奥希替尼R细胞的细胞活力。不同浓度的navitoclax处理细胞48小时。NCI-H1975 / 奥希替尼R细胞的细胞活力明显低于NCI-H1975细胞系，NCI-H1975细胞的细胞活力分别保持在70.48％，62.57％和49.35％，而49.35％，31.94％，对于NCI-H1975/奥希替尼R细胞而言，分别用0.25、0.5和1μM的navitoclax处理后的结果为18.27％。通过集落形成分析进一步证实了NCI-H1975和NCI-H1975/奥希替尼R细胞对navitoclax的细胞活力抑制的差异。与NCI-H1975细胞相比，用navitoclax处理后，在NCI-H1975 / 奥希替尼R细胞中观察到的菌落更少。
为了研究上述现象的潜在机制，研究了navitoclax在两种细胞系中的促凋亡作用。膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）双重标记试验表明，NCI-H1975 /奥希替尼R细胞中Navitoclax处理诱导的凋亡细胞百分比高于NCI-H1975细胞。另外，通过蛋白质印迹研究了作为凋亡的生物标志物的c-PARP和c-caspase 3的蛋白表达。与NCI-H1975细胞相比，navitoclax诱导的c-PARP和c-caspase 3蛋白表达在NCI-H1975 / 奥希替尼R细胞中更为显着。这些数据表明，与NCI-H1975细胞相比，NCI-H1975/奥希替尼R细胞对navitoclax更敏感。
为了进一步证实navitoclax诱导的细胞活力降低是由于navitoclax诱导的凋亡通过激活NCI-H1975 / OSIR细胞中的胱天蛋白酶而引起的。用泛半胱天冬酶抑制剂苄氧基羰基-Val-Ala-Asp（OMe）氟甲基酮（Z-VAD-FMK）预处理后，检测细胞活力和凋亡。navitoclax单独处理组的细胞存活率保持在37.75％，而navitoclax和Z-VAD-FMK联合治疗组的细胞存活率为62.50％。Annexin-FITC和PI染色表明，在NCI-H1975 /奥希替尼R细胞中用10μMZ-VAD-FMK预处理1h后，navitoclax增加的细胞凋亡从25.07％逆转至8.83％。
EGFR阳性突变的NSCLC患者可以受益于EGFR TKI，例如吉非替尼，厄洛替尼和阿法替尼。但是，大多数患者在治疗约12个月后将对这些EGFR TKI产生抗药性。迄今为止，奥希替尼是美国FDA批准的唯一用于EGFR T790M突变的NSCLC患者，在用EGFR TKIs治疗后疾病进展的第三代EGFR TKI。由于可能会出现对OSI的耐药性，因此有必要预先确定奥希替尼可能的耐药机制，并为奥希替尼耐药患者制定有效的策略。在这项研究中，我们通过剂量递增建立了OSI耐药细胞系NCI-H1975 / 奥希替尼R细胞。研究了NCI-H1975 /奥希替尼R细胞在增殖，迁移，侵袭以及对其他EGFR TKI和化学疗法的敏感性方面的生物学特性。奥希替尼仿制药的价格也是非常实惠，需要购买可以添加下方微信。
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