与用AXL特异性siRNA处理细胞并结合使用奥希替尼和NPS1034持续1orh或72h的结果相一致，与高表达AXL的治疗相比，其显着抑制了AXL，EGFR，HER3和AKT的磷酸化单用奥西替尼的细胞系。相反，在低AXL表达细胞系中，与单独的奥希替尼（泰瑞沙）相比，奥希替尼和NPS1034不影响AKT的磷酸化。与单独用奥希替尼处理细胞相比，将另一种AXL抑制剂（ASP2215）与奥希替尼联合使用72小时也能在PC-9和HCC4011细胞中产生相似的作用。 为了进一步阐明AXL轴下游分子的概况，我们研究了奥希替尼与分子靶向药物在高水平AXL的EGFR突变NSCLC细胞中的联合疗效。
与曲美替尼（MEK抑制剂）或咖啡酸苯乙酯（CAPE，NFκB抑制剂）相比，与奥希替尼联合使用时，AKT抑制剂布帕瑞布显示出更多的作用。具有或不具有NPS1034的奥希替尼对干细胞和EMT相关蛋白的表达没有显着影响。 这些结果清楚地表明，通过主要地调节AKT活性，可以通过与AXL抑制剂联合治疗来提高对奥希替尼的细胞敏感性，从而导致高AXL表达EGFR突变的NSCLC细胞系的活力降低。 药物耐受（DT）细胞定义为一小部分细胞，对目标药物的敏感性明显降低。它们是在接触目标药物的几天到几周内产生的。
由于细胞获得抗性，因此认为DT细胞是肿瘤复发的基础。因此，我们检查了AXL是否参与暴露于奥希替尼的DT细胞的出现。在PC-9和HCC4011细胞暴露于奥希替尼（1-3μm）后9天，我们分离了DT细胞。如先前报道的那样，大量PC-9 DT细胞处于细胞周期的G1期。尽管在DT细胞中不影响EGFR等位基因突变的百分比和EGFR基因的拷贝数，但与亲代细胞相比，DT细胞对奥希替尼高度不敏感。先前的研究表明，暴露于厄洛替尼的PC-9细胞衍生的DT细胞通过IGF-1R信号传导维持其生存能力。与先前的报道一致，我们发现对奥西替尼耐药的DT细胞与亲代PC-9细胞相比，具有更高的IGF-1R蛋白表达和磷酸化水平。
此外，与亲代细胞相比，DT细胞表达更高水平的EGFR，HER3和AXL。有趣的是，与亲代细胞相比，DT细胞中AXL磷酸化增加，但EGFR和HER3的磷酸化降低，表明DT细胞的生存能力依赖于AXL和IGF-1R。实际上，与亲代细胞相比，DT细胞中更多的AXL蛋白与EGFR和HER3相关。 AXL抑制剂（NPS1034）和IGF-1R抑制剂（OSI906）均可明显降低DT细胞的活力，但不能降低亲代PC-9或HCC4011细胞的活力。
DT细胞与NPS1034和OSI906的联合处理进一步抑制了它们的生存能力。蛋白质印迹分析表明，虽然奥希替尼不抑制DT细胞中EGFR，HER3，ERK或AXL的磷酸化，但仅NSP1034处理可抑制AXL，EGFR和HER3的磷酸化，因此抑制AKT的磷酸化，但未抑制影响ERK的磷酸化。此外，将PC-9，PC-9GXR和HCC4011细胞与奥希替尼和NPS1034连续进行共处理可防止DT细胞的出现。这些结果表明，除了IGF-1R，AXL在DT细胞向奥美替尼的出现中也起着关键作用。有趣的是，AXL介导的抗药性在无药条件下至少9天是不可逆的，并且不容易逆转。
为了确定AXL是否影响体内表达高AXL的EGFR突变的NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性，我们使用了PC-9细胞，其中通过短发夹RNA（shRNA）的转染连续敲低了AXL的表达。对AXL特异的shRNA的转染导致对AXL蛋白表达的抑制，其中AXL shRNA＃38比AXL敲除时的AXL shRNA37更有效。尽管shRNA转染的PC-9细胞的生长比对照shRNA（PC-9shSCR）转染的PC-9细胞的生长稍慢，但两种敲低的转染子在体外均以恒定速率生长。因此，我们选择了AXL shRNA38转染的PC-9细胞用于后续实验。
在皮下肿瘤模型中，源自细胞的肿瘤的生长速度比源自PC-9shSCR细胞的肿瘤的生长速度慢。在使用PC-9shSCR细胞的模型中，连续的奥希替尼治疗最初会导致轻微的肿瘤消退，但肿瘤会在10天之内重新长大，表明复发迅速。与之形成鲜明对比的是，在使用PC-9shAXL＃38细胞的模型中进行的相同处理导致了明显的肿瘤缩小，肿瘤在实验过程中在24天内从未重新生长。在源自PC-9shAXL＃38细胞的肿瘤中，AXL蛋白的表达被成功敲低。
在实验结束时，每组小鼠均未出现C797S EGFR突变。在治疗的24天中，没有一组小鼠显示出明显的体重减轻。这些数据清楚地表明，AXL在体内保留了经奥希替尼治疗的PC-9细胞的生存力，并且AXL敲低改善了肿瘤对奥希替尼治疗的反应并防止了复发。可以看出，现在奥希替尼的效果还是非常不错的，如果您有需要购买仿制药版本的奥希替尼，可以添加下方微信，我们会提供购买。
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