奥希替尼/奥西替尼的内在抗性并促进耐受细胞的出现

　　EGFR突变的NSCLC细胞（包括PC-9细胞）对第三代EGFR-TKI奥希替尼高度敏感。由于口服80 μmg奥希替尼（奥西替尼）后患者血浆中的Cmax为635.4 nM25，因此我们认为临床上相关的奥希替尼浓度为1 μM或更低。但是，即使用高浓度（1μmM）的奥西替尼治疗72μh后，大约20％至30％的PC-9细胞仍然存活。为了确定这些细胞逃避奥希替尼影响的机制，我们使用磷酸激酶抗体阵列评估了用或不用奥希替尼处理72 h的PC-9细胞中的43种磷酸激酶。

　　我们发现，奥美替尼治疗后某些分子（例如HER3，MET和AXL）的磷酸化增加。因此，我们假设对奥希替尼的耐受性可能是由通过这些蛋白质的生存信号引起的。动力学分析表明，尽管奥美替尼在4h显着抑制EGFR的磷酸化，但在72h可测量地将其重新激活。厄西替尼在4 h也抑制了HER3和MET的磷酸化，但这些蛋白质的磷酸化在24 h被重新激活，并且在72h内逐渐增加。另一方面，虽然AXL未被组成性磷酸化，但它的磷酸化在4 h被奥希替尼诱导，并增加了72h。EGFR的下游分子ERK的磷酸化在4h被奥希替尼显着抑制，并且抑制持续了72h。与之形成鲜明对比的是，EGFR信号的另一个下游分子AKT在4 h被奥希替尼轻微抑制，并在24h被重新激活。

　　这些结果表明，奥希替尼暴露可能激活了PC-9细胞中的AXL，从而重新激活了HER3，MET和EGFR。我们接下来研究了敲低HER3，MET和AXL对PC-9和PC活力的影响-9GXR细胞，其外显子19被删除，EGFR中的T790M突变。在没有奥西替尼的情况下，使用特异性siRNA敲低HER3，MET和AXL分别导致PC-9和PC-9GXR细胞存活率分别降低30-40％，25％和小于20％。奥希替尼将PC-9和T790M阳性PC-9GXR细胞的活力抑制了50％，与其作为第三代EGFR-TKI的活性一致。在存在奥希替尼的情况下持续72h，MET的敲低并不影响细胞活力，而HER3或AXL的敲低进一步降低PC-9和PC-9GXR细胞的存活率至约20％。

　　这些结果表明，AXL和HER3可能促进了一部分EGFR突变的NSCLC细胞的存活，其中通过奥希替尼暴露72 h抑制了EGFR信号。与奥希替尼治疗相比，当用对EGFR有特异性的siRNA处理PC-9和PC-9GXR细胞时，细胞活力降低了25–30％。 HER3的敲低也使细胞活力降低了25-30％，但是AXL的敲低仅使细胞活力有些降低。这些结果与以前的发现一致，即EGFR和HER3的异源二聚化有助于维持EGFR突变的NSCLC细胞中的致癌信号26。在这些实验条件下，与单独的EGFR敲低相比，EGFR和AXL或HER3的双重敲除表现出更大的细胞活力降低。

　　有趣的是，HER3和AXL的双重敲除与EGFR和AXL的双重敲除一样有效地降低了细胞活力，表明AXL和EGFR或HER3之间存在相互作用。 接下来，我们检查了PC-9细胞中这些分子的磷酸化状态，无论是否敲低AXL或HER3。用特异性siRNA处理PC-9细胞可有效降低AXL或HER3的蛋白表达。在用对照siRNA处理的PC-9细胞中，h仅导致EGFR磷酸化的轻微抑制，这与图1b中所示的结果一致，可能是由于重新激活所致。有趣的是，在用siRNA处理AXL的PC-9细胞中，同样的奥希替尼处理可大大抑制EGFR和HER3的磷酸化。

　　在用HER3的siRNA处理的PC-9细胞中未观察到此现象。免疫沉淀后的免疫印迹显示，用奥希替尼治疗72 h后，AXL与HER3和EGFR的结合增强，但与HER3与EGFR的结合却未增强。这些结果表明，AXL被奥西替尼暴露激活，并在某些PC-9和PC-9GXR细胞中维持了细胞存活，大概是通过与EGFR和HER3相互作用。 为了评估奥希替尼逆向激活AXL磷酸化的机制，我们研究了ERK到新芽（SPRY）家族蛋白的负反馈环的参与，该环回抑制了各种受体酪氨酸激酶的磷酸化27,28。奥西替尼治疗可降低PC-9细胞中SPRY4的水平。使用特异性siRNA敲低SPRY4可增加磷酸化AXL的表达。

　　相反，SPRY4的过表达维持了暴露于奥希替尼的PC-9细胞中磷酸化AXL的表达水平。这些结果表明，奥希替尼至少部分地通过切断SPRY4的负反馈回路来不利地激活了AXL，从而抑制了AXL的磷酸化。 接下来，我们试图评估EGFR突变的NSCLC细胞系中AXL表达与对EGFR-TKI（包括奥希替尼）的敏感性之间的相关性。将九种测试的EGFR突变的NSCLC细胞系分类为具有高水平的AXL表达（AXL-β肌动蛋白比率> 7.0）和低水平的AXL表达（AXL-β肌动蛋白比率≤7.0）的那些。在AXL表达水平相对较低的细胞中，EGFR的磷酸化和SPRY4水平趋于升高；然而，上皮间质转化（EMT）相关蛋白，总EGFR或磷酸化HER3的表达没有明显差异。重要的是，奥希替尼和吉非替尼的半数最大抑制浓度（IC50）在表达相对较高的AXL表达水平的细胞中均显着高于在表达较低的细胞中。另外，在几种相关蛋白中，AXL表达水平与奥希替尼敏感性具有最强的正相关。现在奥希替尼仿制药的价格是多少？在哪里购买？更多详情可咨询下方微信。