曲美替尼trametinib是有效的化合物

　　大多数(约80%)的婴儿急性淋巴细胞白血病(ALL)病例以染色体重排为特征，涉及混合血统白血病(MLL，或KMT2A)基因，预后较差:无事件生存的机会最多为30-40%。我们和其他研究人员发现，14-36%的mll重排ALL病例发生了RAS亚克隆突变，这取决于mll易位的亚型。RAS突变进一步降低了患者的生存机会，复发迅速发生，基本上没有生存的机会。最近，我们发现MEK抑制剂在体外能有效杀死ras突变的婴儿所有细胞，而曲美替尼是最有效的化合物。因此，我们提出，曲美替尼可能对mll重排的ALL患者具有额外的RAS突变有利。在这里，我们报道了曲美替尼在ras突变型mll重排婴儿全鼠异种移植模型中的临床前评估。　

　　trametinib以来曾在小鼠模型研究了其他恶性肿瘤和被接受治疗BRAF-mutant黑色素瘤,我们基于这些研究我们的计量制度,管理5毫克/公斤(低)或30毫克/公斤(高)trametinib每周3次通过腹腔内注射毒性评估(n=3老鼠每组)。一周内，30mg/kg曲美替尼组3只小鼠中有2只死亡，最后一只小鼠因体重减轻而被人道安乐死。车辆和5mg/kg的曲美替尼可耐受长达28天，没有不适或体重减轻的迹象。　　

　　其中一只曲美替尼小鼠比它的同窝小鼠小，但没有迹象表明要把它排除在研究之外。组织切片苏木精和伊红(HE)染色显示高剂量曲美替尼诱导肾脏损伤，而低剂量曲美替尼组和非剂量组不存在这种损伤。令人惊讶的是，高剂量的曲美替尼也会导致脾脏中髓系细胞的丰度增加，这类似于脾髓外造血(EMH)。此外，我们观察到接受低剂量曲美替尼的小鼠骨髓中造血细胞的消耗，而这种情况在注射药物的小鼠中没有发生。虽然高剂量曲美替尼的骨髓组织无法获得，但高剂量曲美替尼可能诱发更严重的骨髓衰竭，引发脾EMH。　　

　　为了评估曲美替尼在体内的疗效，我们将ras突变体mll重排的婴儿ALL细胞系KOPN8(106个细胞;尾静脉注射)，之前用荧光素酶报告基因转导(从现在起称为KOPN8-SLIEW)。随后，通过生命内成像评估1周的移植物。随机分组后，开始使用车辆或曲美替尼治疗(5mg/kg，每周3次)，并通过每周生命内成像跟踪白血病进展。　　

　　在载体组和曲美替尼治疗的小鼠中，系统性白血病在两周内都发生了，尽管载体组小鼠更严重，在第14天最明显。生命内成像的定量显示，曲美替尼单药治疗延缓了白血病进展，但不足以防止白血病生长出。曲美替尼对白血病进展的适度影响促使我们研究其作用机制是否在我们的模型中实现。　　

　　因此，在处死小鼠前(第17天)4小时，随机选取车辆组和曲美替尼组各2只小鼠，给予曲美替尼(5mg/kg)bolus注射，随后分析组织样品中ERK的激活情况。取小鼠脾、骨髓和外周血。与生命内影像学数据一致，两组患者均出现脾肿大，脾脏重量无显著差异。处理组织后，用流式细胞术分析白血病细胞的存在。　　

　　大多数来自载体或曲美替尼治疗的脾脏的细胞都代表了人类白血病细胞。然而，8个曲美替尼治疗的小鼠中有4个骨髓抽吸物中的白血病负荷降低到10-30%，而其余小鼠的骨髓白血病负荷与药物治疗组相似(80-95%)。　　

　　此外，我们观察到曲美替尼治疗的小鼠外周血中白血病细胞比对照组减少(分别为12%和23%)，尽管这种差异没有统计学意义。接受曲美替尼大剂量注射的小鼠与未接受大剂量注射的小鼠比较。在骨髓抽吸物中观察到的双峰效应与性别、总体重或脾脏重量、外周血中的白血病细胞或年龄无关。　　

　　为了进一步研究载药组和曲美替尼组小鼠骨髓中白血病细胞的分布情况，我们对骨髓组织切片进行了HE染色。有趣的是，在载体骨髓中，我们观察到严重的白血病细胞浸润，而曲美替尼治疗的小鼠所选择的骨髓中，白血病负荷降低，实际上细胞数量减少。虽然这些低细胞骨髓不同于健康骨髓，但这可能是由于曲美替尼诱导的白血病细胞死亡，而不是毒性，正如曲美替尼用于转移性黑色素瘤的批准和最近在其他血友病中的临床研究所提示的那样。　　

　　由于在mll重排的婴儿中RAS突变都与中枢神经系统(CNS)浸润增强有关，因此我们研究了固定颅骨切片是否存在白血病细胞。有趣的是，在3个曲美替尼治疗的小鼠中，有2个显著减少了白血病对软脑膜间隙的浸润，而所有的载具小鼠都出现了细胞侵袭。　　

　　我们电泳分解脾脏和骨髓样本的蛋白裂解物，并研究ERK去磷酸化作为曲美替尼疗效的标记。有趣的是，非注射的载体小鼠脾脏样本有明显的ERK磷酸化(pERK)，而注射了一剂的载体小鼠的pERK信号明显较低。此外，曲美替尼通过连续注射(黑色条)和在车辆组小鼠中单次注射(白色条)抑制了所有脾分离物中的ERK磷酸化，这一点通过量化这些印迹的相对pERK信号得到证实。　　

　　另外，bolus和非bolus小鼠的骨髓样品(经磁活化细胞分选纯化前;MACS)含有类似的白血病细胞百分比。有趣的是，车用骨髓样本显示了与脾样本相似的ERK磷酸化模式，曲美替尼丸降低了pERK水平，而曲美替尼组大剂量注射也伴有ERK磷酸化降低。定量的印迹显示，在非大剂量骨髓中，尽管大剂量的曲美替尼有效地减少了ERK磷酸化，但代谢物组和曲美替尼组之间几乎没有差异。因此，连续的曲美替尼治疗不会导致脾脏中pERK水平的持续下降，但注射曲美替尼会暂时降低骨髓中的pERK水平。　　

　　虽然MEK抑制先前被证明在ras突变型bcpall异种移植模型中有效，但在我们的mml重排婴儿ALL模型中，曲美替尼不能显著抑制白血病进展。然而，曲美替尼治疗确实影响了移植物的定位，特别是ras-突变的mll-重排的ALL细胞的骨髓和脑浸润。MEK抑制ras突变株mll重排ALL和BCP-ALL的效果差异可能是由细胞遗传学亚型和相关结果的差异来解释的。　　

　　有趣的是，Prieto等发现，在人mil重排ALL细胞系SEM的小鼠异种移植中，KRASG12V的异位表达显著促进了中枢神经系统的浸润，同时我们的数据表明，MEK抑制可能会减少中枢神经系统的参与。此外，MEK抑制剂selumetinib显著降低了儿童ras突变型BCP-ALL异种移植模型中中枢神经系统的浸润　　

　　来自曲美替尼组的脾源性白血病细胞表现出持续的pERK水平降低，而在车辆组，一剂曲美替尼注射也可以降低pERK水平。此外，我们观察到8只小鼠中有4只接受了曲美替尼治疗，而在骨髓高白血病小鼠中，注射曲美替尼后，ERK磷酸化水平降低。可能是曲美替尼清除降低了其作用，或者替代信号机制恢复pERK，我们的给药频率太低，无法诱导持续抑制ERK磷酸化。虽然更频繁的给药可能会提高疗效，但存在毒性风险。然而，其他关于患者来源的异种实体瘤的研究使用每日口服剂量(0.3-3mg/kg)，而我们选择腹腔给药以更好地控制曲美替尼水平，这些对某些模型的持久研究结果比我们观察到的效果更好。　

　　所有携带RAS突变的患者的生存机会接近于零。由于曲美替尼降低了ERK磷酸化，这是RAS突变体的一个关键下游效应，这意味着曲美替尼治疗可以逆转RAS突变对mll-重排ALL的影响，导致对标准治疗的反应更类似于RAS野生型mll重排ALL。此外，糖皮质激素耐药仍然是mll重排婴儿ALL的一个有害特征，并与RAS基因突变有关。先前，我们和其他人已经证明MEK抑制剂曲美替尼、selumetinib和MEK162对糖皮质激素均敏感。5,14,15这提示曲美替尼与糖皮质激素联合治疗可能是有益的。　　

　　总之，虽然单药治疗无法在体内系统抑制ras突变的mll重组ALL，但半数小鼠的骨髓白血病负担减轻，而且曲美替尼trametinib有效地降低了骨髓和脾脏白血病细胞中ERK磷酸化。详情请扫码咨询：