分析达拉非尼Dabrafenib对细胞周期的影响

　　为了鉴定对B-RAFV600E抑制作用耐药的黑色素瘤细胞的表型，我们使用3株黑色素瘤细胞株A375、397和624.38生成了对dabrafenib(一种B-RAFi)耐药的黑色素瘤细胞，这些细胞株都携带B-RAFV600E突变，对dabrafenib敏感。　　

　　在存在30nM达拉非尼的情况下，以低密度电镀的细胞在7天后只能形成少量数量可观的菌落，与未处理细胞中观察到的菌落相当，正如预期的那样。

　　我们选择在药物处理下能够增殖并形成菌落的少数细胞，如《材料和方法》中所述，在含有增加浓度的达拉非尼的培养基中培养它们。由此得出的达拉非尼耐药黑色素瘤细胞为A375_B-RAFi(R)、397_B-RAFi(R)和624.38_B-RAFi(R)。由于对黑色素瘤B-RAFV600E抑制的耐药是可逆的和适应性的，所以我们对耐药细胞进行了描述，在药物选择压力下，它们的扩张后。　　

　　为证实A375_B-RAFi(R)、397_B-RAFi(R)和624.38_B-RAFi(R)细胞对达拉非尼治疗有耐药性，采用生存比色法测定其IC50值。A375和衍生的达拉非尼耐药黑素瘤细胞A375_B-RAFi(R)，在增加浓度的B-RAFi(0，0.1，1，5，25和100nM)处理6天。剂量响应分析显示，达拉非尼耐药细胞的IC50值为110.5μM，而达拉非尼敏感细胞A375的IC50值为9.5nM。同样，对397_B-RAFi(R)细胞测定达拉非尼的IC50值为280μM，而对397个药物敏感细胞测定的IC50值为0.006nM。最后，将624.38和624.38_b-rafi(R)细胞以增加浓度的B-RAFi(0、5、25、50、100和500nM)处理6天。624.38_b-rafi(R)细胞的dabrafenibIC50值为0.1μM，624.38药物敏感细胞的IC50值为12nM。　　

　　采用流式细胞仪分析达拉非尼对细胞周期的影响。PI的细胞周期分析显示，对达拉非尼敏感和耐药黑色素瘤细胞之间存在显著差异。显著积累细胞G0/G1期(分别为91.9和45.1%，dabrafenib-treated与未经处理的)，相应的减少在G2/M期细胞的数量(分别为0.69和11.8%，dabrafenib-treated与未经处理的)被发现在A375细胞的b-raf抑制剂治疗。相反，在A375_B-RAFi(R)细胞中，达拉非尼没有显著的G0/G1阻滞反应。同样，G0/G1期细胞的积累减少数量的G2/M期细胞观察397年和624.38黑色素瘤细胞，治疗B-RAFi时，虽然没有明显的细胞周期配置差异检测抗397_B-RAFi_b-rafi(R)和624.38(R)黑色素瘤细胞系，在b-raf抑制(数据没有显示)。　　

　　最后，为了确定这些黑色素瘤细胞对达拉非尼的耐药是否与MAPK信号通路的重新激活有关，我们评估了用MEK抑制剂治疗这些细胞是否损害了达拉非尼耐药细胞的活力。这些细胞对MEK抑制剂曲美替尼(trametinib)敏感，支持了达拉非尼耐药性与MAPK信号的重新激活之间的关联。　

　　为了评估耐药状态发展过程中突变模式的差异，使用高通量离子流测序技术对达拉非尼敏感和耐药黑素瘤细胞株进行了分析，如《材料和方法》中所述。突变筛选使用的是IonAmpliSeqCancerHotspotPanelv2，包含>200对产生短(平均150bp)扩增子的引物，这些短扩增子针对50个主要致癌基因和参与肿瘤发生的抑癌基因的热点区域。详情请扫码咨询：