NEK9是达拉非尼Dabrafenib的一个有效靶点

　　Vemurafenib和dabrafenib在临床上广泛用于BRAF突变黑色素瘤的治疗。尽管它们的疗效相似，但在副作用方面观察到显著差异。这让我们推测，与vemurafenib相比，dabrafenib可能抑制了一系列不同的激酶靶点，这些靶点可能对BRAF野生型肿瘤有活性。与此一致的是，我们的初步研究表明，达拉非尼比vemurafenib更有效地抑制NRAS‐和KRAS‐突变的癌细胞株的生长。　

　　为了更好地了解dabrafenib和vemurafenib在效果上的差异，我们进行了化学蛋白质组学筛选，以确定独特的非靶标激酶的光谱。化学蛋白质组学是一种创新的方法，使用感兴趣的药物“拉下”相互作用的蛋白质和激酶，然后使用质谱鉴定。它提供了公正和高度敏感的优点，以及捕捉药物对蛋白质-蛋白质复合物的作用-这不能通过体外激酶分析实现。之前的研究，使用细胞类型不可知的体外激酶检测，已经确定了vemurafenib的其他潜在靶点。　　

　　在这里测试的三种药物中，曲美替尼的靶谱最窄，基本上只与MAP2K激酶家族成员相互作用。这可能反映了变构MEK抑制剂相对于ATP竞争性BRAF抑制剂的高度特异性。我们的化学蛋白质组学分析发现了一系列之前未被识别的达拉非尼靶标，包括CAMK1α、CDK16和NEK9。NEK9和CDK16被选为进一步研究的对象，是基于它们被达拉非尼体外激酶测定的有效抑制作用，以及通过初步的siRNA实验，在这些实验中，它们的沉默抑制了NRAS‐突变的黑素瘤细胞的生长。

　　NEK9是有丝分裂基因A(NIMA)相关激酶(NEKs)丝氨酸/苏氨酸激酶的11‐家族成员之一，其主要作用是控制细胞周期检查点。在功能上，NEK9在有丝分裂中最有特点，它通过下游激酶NEK6和NEK7调节中心体分离和纺锤体组装。NEK9的表达在复制应激反应中增加，导致其与CHK1的关联和CHK1激酶活性的增加。在三阴性乳腺癌细胞中，NEK9沉默会增加复制应激水平，导致自发的DNA损伤和增强对DNA损伤化疗药物的敏感性。在其他系统中，NEK9表达的下调会破坏微管动力学，并与有丝分裂灾难相关。最近的一项无偏的蛋白质组学筛选也表明NEK9是ATG8子网的一部分，是一种潜在的自噬介质。NEK9在复发性胶质瘤和伊马替尼耐药慢性髓系白血病(CML)中表达增加的几种癌症中被发现。最近，它也被确认为具有失活p53的癌细胞系中关键的细胞周期调节因子，并被提议作为这些肿瘤的潜在治疗靶点。NEK9在黑色素瘤中的潜在作用尚未被研究过。　　

　　我们通过体外激酶检测证实NEK9是达拉非尼的一个有效靶点，并在单数量级的纳米摩尔范围内观察到NEK9的抑制作用。在一项基于NRAS和KRAS突变的癌细胞的细胞研究中，达拉非尼抑制NEK9靶点CHK1，而vemurafenib则没有。NEK9基因敲低的影响表现在细胞周期水平上，表现为G1期阻滞、衰老标志物的诱导和p21表达的增加。尽管NEK9主要与有丝分裂调控有关，但我们在其沉默后的黑素瘤细胞系中没有观察到任何有丝分裂灾难。NEK9抑制和NRAS‐或KRAS‐突变细胞在G2/M纺锤体检查点的阻滞也未见影响。　　

　　最近的研究表明，NEK9在基因转录中可能还具有其他不太明确的作用，可能是一种转录抑制因子。这在腺病毒感染的细胞中表现得最为明显，其中NEK9协同抑制p53介导的GADD45A表达，防止细胞周期阻滞和细胞应激。更全面的、基于RNA序列的分析表明，NEK9在调节细胞周期相关mrna中的作用，其沉默导致p21表达增加，p38MAPK和CDK4表达降低。我们的结果支持了这些发现，并揭示了NEK9在控制p21和CDK4表达中的作用，这两种蛋白的改变可能解释了我们观察到的潜在的细胞周期阻滞。尽管我们的数据表明NEK9在转录水平上调控CDK4的表达，但这种作用的确切机制仍有待确定。药理学研究表明，NEK9沉默和CDK4抑制之间的细胞周期效应存在联系，在NRAS和KRAS突变的癌细胞株中，CDK4抑制剂palbociclib和ribociclib也可诱导G1期细胞周期阻滞和衰老。　

　　最近的研究表明，缺乏p53功能的癌细胞依赖于NEK9进行增殖。对我们的NRAS和KRAS突变细胞系的基因图谱分析显示，这些突变中有许多带有失活的p53突变。为了进一步确定达拉非尼治疗后NEK9抑制的p53依赖性，我们评估了这两种BRAF抑制剂对等基因p53+/+和p53−/−HCT116细胞的影响，发现达拉非尼选择性地抑制pCHK1，并在p53‐零的细胞中增加p21表达。与p53+/+细胞相比，达拉非尼在p53−/−HCT116细胞中增强了生长抑制作用，进一步表明NEK9在缺乏p53功能的癌细胞生长中的作用。虽然我们对黑色素瘤TCGA数据库的分析显示，NEK9表达水平高与整体生存期较差相关，但我们无法将其与p53突变状态联系起来。这可能是由于黑素瘤并不经常发生p53突变，而是通过其他手段，如MDM2和MDM4的高表达，使p53失活。　　

　　我们的数据表明，dabrafenib是一种有效的NEK9抑制剂，它也有可能击中其他靶点，因此我们下一步将注意力转向CDK16(或PCTAIRE1)。多项研究已经证明CDK16在癌症进展中的作用，前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌细胞系相对于正常细胞表达增加。在癌细胞中，CDK16通过与p27KIP1相互作用参与细胞周期调控，催化p27在S10位点磷酸化，导致其降解。　　

　　CDK16也被认为是BRAF突变黑色素瘤的治疗靶点，与良性痣相比，该蛋白在黑色素瘤转移中表达增加。在体内和体外，通过shRNA沉默CDK16可以抑制BRAF‐突变的黑色素瘤细胞株的生长。我们证实了这些发现，并通过对TCGA黑色素瘤数据集的分析表明，CDK16的高表达与较短的总生存期相关。在BRAF和NRAS突变的黑色素瘤细胞系中，CDK16的沉默导致了与p27表达相关的细胞周期阻滞，并降低了RB蛋白在S780位点的磷酸化。在这些病例中，研究人员通过达拉非尼(而非vemurafenib)，重新研究了RAS‐突变型癌细胞株中CDK16沉默的影响。　

　　许多有效的抗癌药物同时抑制多个细胞靶点。这种现象被称为“多药理学”(polypharmacology)，可能在许多FDA批准的药物中都很常见，其进一步研究为已经经过临床安全性测试的药物重新使用提供了可能性。研究结果表明，达拉非尼的一些超靶效应，如NEK9和CDK16，在临床可达到的剂量下受到抑制，这可能有助于提高其疗效，特别是对缺乏BRAF突变的癌症。值得注意的是，我们发现FDA批准的BRAF激酶抑制剂达拉非尼是第一个已知的NEK9抑制剂。　　

　　研究人员对NEK9作为p53突变型癌症(包括KRAS突变型结肠癌和非小细胞肺癌(NSCLC))的治疗靶点越来越感兴趣，因此这一发现具有重要意义。NEK9在胶质母细胞瘤中也高表达，通过增加对DNA损伤的敏感性，有可能使这些肿瘤对化疗敏感。进一步的研究表明NEK9在病毒复制中的作用。因此，我们建议达拉非尼Dabrafenib可以重新使用，特别是作为NEK9的抑制剂，有可能扩大其临床应用到其他环境。详情请扫码咨询：