达拉非尼Dabrafenib显著激活多种其他激酶

　　在分离的激酶试验中，dabrafenib和vemurafenib对突变的BRAF有不同的效力，我们确定了抑制1205LuBRAF‐突变的黑色素瘤细胞pERK所需的等效浓度，并鉴定出100nm达拉非尼与1μmvemurafenib的效果相当。为了确定vemurafenib和dabrafenib是否对BRAF突变和NRAS突变的黑色素瘤细胞的生长有不同的影响，我们用每种药物长期(>14天)处理1205Lu(BRAF突变)和WM1366细胞(NRAS突变)，并进行细胞计数。结果发现，这两种BRAF抑制剂均能抑制1205Lu细胞的生长超过14天，但几乎没有观察到再生。NRAS‐突变的黑色素瘤细胞的治疗显示了非常不同的反应模式，vemurafenib最初抑制生长。　

　　相比之下，达拉非尼治疗导致了长期的生长抑制，并且没有逃脱。这些反应的持久性由4周的菌落形成实验决定，其中dabrafenib完全抑制WM1366细胞生长，而vemurafenib没有。在BRAF突变1205Lu和M249细胞中，dabrafenib和vemurafenib在抑制长期生长方面具有相似的效果。这些影响并不局限于WM1366细胞系dabrafenib也表现出长期增长抑制其他RAS突变黑色素瘤癌细胞线,包括地理IPC298(国家管制当局方面突变)和M249R细胞(一种细胞系,最初BRAF突变和获得一个国家管制当局方面在BRAF抑制剂耐药突变)。　　

　　在功能上，dabrafenib导致BRAF和RAS突变的黑色素瘤细胞株生长受阻，发现G1期细胞周期阻滞(WM1366细胞的生长阻滞率为10%)。在BRAF突变的黑色素瘤细胞中，Vemurafenib仅与G1期细胞周期阻滞有关，而与NRAS突变的细胞无关。　　

　　由于dabrafenib和vemurafenib对BRAF‐和RAS‐突变的黑色素瘤细胞株表现出不同的活性，我们接下来想知道dabrafenib是否有独特的激酶靶点。为了探索这一点，我们应用了一种无偏的化学蛋白质组学方法。我们合成了dabrafenib和vemurafenib类似物，命名为i-dabrafenib和i-vemurafenib，它们可以固定在琼脂糖珠上。　　

　　由于MEK抑制剂与BRAF抑制剂联合使用，我们还合成了MEK抑制剂trametinib的固定化类似物i-trametinib，用于我们的分析。在分离的BRAF‐V600E和MEK2激酶检测中，修饰的dabrafenib、vemurafenib和曲美替尼类似物分别显示了与母体化合物相似的药理活性。然后，药物亲和力基质与BRAF突变1205Lu细胞或NRAS突变WM1366细胞的裂解液孵育。随后的串联质谱分析药物亲和洗脱液和使用归一化光谱丰度因子(NSAF)的相对、无标记定量显示，达拉非尼和vemurafenib对BRAF和CRAF具有预期的高亲和力。　　

　　然而，在达拉非尼和vemurafenib靶蛋白谱上也有显著差异，达拉非尼显著激活多种其他激酶。化学蛋白组学筛选的结果通过体外激酶检测得到验证，证实达拉非尼显著抑制了包括CAMK1α、MAP3K11、CDK16和NEK9在内的许多激酶。其中，NEK9是最有效的，也是唯一的达拉非尼靶标，其IC50值为1‐9nm，其次是CAMK1α和CDK16。由于CAMK1α在WM1366细胞中不表达(数据未显示)，我们重点研究了NEK9和CDK16作为WM1366细胞中最有效的达拉非尼新靶点的作用。　　

　　1205Lu和WM1366细胞裂解物的westernblot验证了达拉非尼对NEK9和CDK16的靶向作用，其中i‐达拉非尼和i‐vemurafenib均能抑制BRAF，但只有i‐达拉非尼能与NEK9和CDK16相互作用。与达拉非尼Dabrafenib和vemurafenib相互作用的多激酶靶点相比，MEK抑制剂曲美替尼具有高度特异性，典型靶点MEK1和MEK2是最显著的相互作用物。详情请扫码咨询：