乐伐替尼7080与VEGFR2的动力学相互作用分析

　　乐伐替尼是一种口服多激酶抑制剂，可选择性抑制血管内皮生长因子(VEGF)受体1-3和其他促血管生成和致癌通路相关受体酪氨酸激酶。为了阐明乐伐替尼对VEGF受体2(VEGFR2)抑制作用的来源，我们进行了乐伐替尼与VEGFR2的动力学相互作用分析，并对VEGFR2-乐伐替尼复合物的晶体结构进行了x射线分析。动力学分析表明，乐伐替尼与VEGFR2的配合物具有快速的结合速率常数和相对缓慢的分解速率常数。共晶结构分析表明，乐伐替尼在其ATP模拟喹啉部分通过环丙烷环与ATP结合位点和邻近区域结合，采用Asp-Phe-Gly(DFG)-“in”构象。这些结果表明，乐伐替尼在相互作用的结合模式上与几种已批准的VEGFR2激酶抑制剂非常不同。　　

　　血管内皮生长因子(VEGF)是生理性和病理性血管生成的重要调节因子，对肿瘤生长和转移至关重要。VEGF受体2(VEGFR2)的几种小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已被批准用于几种类型的癌症的治疗，包括肾细胞癌，肝细胞癌和结直肠癌。　

　　所有目前批准的VEGFR2TKIs都与atp结合位点结合。根据VEGFR2与它们的配合物的构象，可以将它们分为I型或II型抑制剂，这是通过共晶结构分析发现的。I型抑制剂以VEGFR2的活性形式为目标，其特征是激活环的开放构象。这种构象被称为“DFG-in”，这是从活化环开始的保守的三元组asp-pheo-gly(DFG)的取向来看的。以失活的DFG-out构象为靶点的抑制剂，其DFG基序相对于活性状态下的方向翻转，被归类为II型抑制剂。一般来说，I型抑制剂具有更快的缔合和解离动力学，而II型抑制剂具有较慢的结合动力学，导致较长的停留时间(即化合物占据靶点的时间)。　　

　　乐伐替尼口服multikinase抑制剂，选择性地抑制VEGFR13和其他proangiogenicprooncogenic受体酪氨酸激酶，包括纤维母细胞生长因子受体1到4等，乐伐替尼目前正在评估在一些临床试验，包括3期临床试验患者的甲状腺癌和肝细胞癌。最近，乐伐替尼在分化型甲状腺癌患者的3期临床试验中达到了主要终点。为了深入了解乐伐替尼与VEGFR2相互作用的模式，我们分析了乐伐替尼与VEGFR2相互作用的动力学，以及VEGFR2与乐伐替尼复合物的晶体结构。

　　抑制剂与目标蛋白之间的亲和力受缔合率和解离率之间的平衡影响。为了阐明乐伐替尼对VEGFR2亲和力的关键驱动因素是哪个参数，我们使用Proteros报告基因置换实验确定了相互作用的动力学参数。该分析基于设计用于与目标酶感兴趣位点结合的报告探针的使用。报告者和目标之间的接近导致光信号的发射。通过监测抑制剂引起的探头位移信号损失来确定动力学参数。我们还用VEGFR2确定了索拉非尼和舒尼替尼的动力学参数，从它们的共晶结构来看，它们分别是典型的II型和I型VEGFR2抑制剂。索拉非尼和舒尼替尼与VEGFR2相互作用的动力学参数清楚地表明了这些抑制因子相互作用方式的报道特征。　　

　　索拉非尼具有慢结合动力学，停留时间为64min，而舒尼替尼具有快速结合动力学；其停留时间低于VEGFR2报告基因置换实验的检测限(2.9min)，我们无法确定关联速率常数(kon)和解离速率常数(koff)值。与这两种代表性抑制剂相比，乐伐替尼具有中间特性。乐伐替尼的kon值为索拉非尼的61倍，koff值为索拉非尼的3.8倍。乐伐替尼的停留时间比舒尼替尼长17min。乐伐替尼可能与VEGFR2快速结合，比舒尼替尼驻留时间更长。这些差异也反映在乐伐替尼、索拉非尼和舒尼替尼与VEGFR2配合物的平衡解离常数(Kd)值上，分别为2.1、33和30nmol/L。由于乐伐替尼与VEGFR2缔合率快，停留时间长，对VEGFR2的作用是索拉非尼和舒尼替尼的10倍以上。　　

　　接下来，我们分析了VEGFR2与乐伐替尼或sorafenib的配合物的晶体结构。首先，我们纯化了重组表达的人VEGFR2激酶结构域(Leu814-Asn1162)，并与乐伐替尼或索拉非尼孵育。采用共结晶法制备了VEGFR2单晶。这些结构的分辨率分别为1.57a(乐伐替尼)或1.90a(sorafenib)，揭示了每种抑制剂与VEGFR2结合模式的细节。VEGFR2与索拉非尼复合物的整体结构采用真核蛋白激酶家族特有的双叶结构。索拉非尼位于n端和c端叶之间形成的裂隙中，同时结合atp结合位点(蛋白激酶的共同位点)和邻近的非保守变构区。17在VEGFR2-sorafenib复合物中，DFG基序采用了DFG-out构象(非活性形式)。这些索拉非尼的结果与McTigue等人报道的结果一致。　　

　　对VEGFR2-乐伐替尼配合物晶体结构的x射线分析表明，乐伐替尼与VEGFR2的结合方式与索拉非尼与VEGFR2的结合方式有一定的不同。乐伐替尼也位于两叶之间的裂口。但VEGFR2与乐伐替尼复合体的构象闭合程度较低，可能与DFG基序构象不同有关。VEGFR2-乐伐替尼复合物与VEGFR2-sorafenib复合物之间DFG基序和激活环n端部分的构象存在显著差异。DFGmotif在VEGFR2-乐伐替尼complex中采用DFG-in构象，而在VEGFR2-sorafenibcomplex中采用DFG-out构象。后者的构象可能是由于索拉非尼的4-氯-3-(三氟甲基)苯基的大量残留占据了邻近区域。相反，乐伐替尼的小取代基环丙烷环可能允许该抑制剂以DFG-in构象与VEGFR2结合。诱导拟合机制是酶抑制剂最常见的慢结合机制。对于与索拉非尼的高亲和力结合，VEGFR2的构象由DFG-in变为DFG-out。这种构象变化可能是索拉非尼低孔的原因。相比之下，乐伐替尼结合时则不存在这种构象变化。这可能解释了这些化合物之间kon的巨大差异。　　

　　这些氨基酸残基属于atp结合位点、把关位点和邻近区域。在25个氨基酸残基中，乐伐替尼和索拉非尼结合位点共有16个。　　

　　乐伐替尼和sorafenib在其核心处结合，从尿素基团到喹啉环(乐伐替尼)和吡啶(sorafenib)，再到atp结合位点。这些核心占据几乎相同的位置。在给体与受体原子距离小于3.5a的基础上，我们鉴定出乐伐替尼与Cys919和Asp1046的主链原子和Glu885的侧链原子共4个特定的氢键；以索拉非尼为例，这些地点共有5个化学键。Asp1046的氮原子与配体尿素基团的氧原子之间的氢键均存在于两种结构中。索拉非尼在铰链区形成了两个氢键，而乐伐替尼只有一个。然而，乐伐替尼在铰链区与酰胺基团形成了额外的亲水性相互作用。富含甘氨酸的环在索拉非尼的结构上是完全有序的，但在乐伐替尼的结构上大部分是灵活的。在sorafenib的结构中，该循环的转向由遵循DFG基序的Leu1049到Ala1050残基支持。这些残基在乐伐替尼的结构中是完全灵活的。　　

　　在VEGFR2-乐伐替尼配合物中，乐伐替尼喹啉环上的6-甲氨基取代基与Asn923的主链和侧链通过水分子桥接产生了两种可能的亲水作用；我们在VEGFR2-sorafenib复合体中没有发现这些。与铰链区的氢键可能是一种必不可少的相互作用。通过结合位点的连接面观察，可以清楚地看到乐伐替尼完全占据了腺嘌呤环结合位点，并在入口区域有很强的疏水相互作用。入口区域由于其序列和构象的多样性，经常被用来获得选择性；它也可能对停留时间有积极影响。　　

　　乐伐替尼也通过与尿素基相邻的部分环丙烷环与ATP结合位点附近的区域结合；索拉非尼通过4-氯-3-(三氟甲基)苯环与邻近区域结合。这些相互作用可能有助于延长VEGFR2复合物的停留时间。舒尼替尼作为典型的I型抑制剂，与邻区无相互作用，停留时间较短。乐伐替尼的环丙烷环与Phe1047的苯环存在CH-pi相互作用。虽然CH-pi相互作用是一种弱分子力，但有时在配体-蛋白质结合中起重要作用。CH-pi的相互作用可能有助于延长乐伐替尼与VEGFR2复合物的停留时间。　　

　　总之，动力学相互作用分析和共晶结构分析揭示了乐伐替尼与VEGFR2相互作用的不同方式。乐伐替尼与VEGFR2和靶VEGFR2在DFG-in构象中具有快速的结合速率常数。此外，乐伐替尼（乐伐替尼7080）还与VEGFR2激酶atp结合位点附近的区域相互作用。与I型抑制剂相比，这种相互作用可能有助于延长滞留时间。据我们所知，乐伐替尼是第一个在3期临床试验中评估的V型激酶抑制剂。为了探索乐伐替尼独特的结合模式与临床活性的关系，可能需要进一步的临床研究进行验证。详情请扫码咨询：