C797S突变被认为是奥希替尼AZD9291获得性耐药的主要机制

　　在研究中，我们证明奥希替尼在H1650GR中不需要T790M就可以克服吉非替尼的获得性抗性。而在KRAS突变的A549GR中，奥希替尼无法克服吉非替尼的获得性抗性。10μM奥希替尼处理后A549GR的发光值下降，其原因可能是抑制细胞增殖的细胞数量较对照组减少。

　　在之前的一项研究中，抗吉非替尼的PC9(PC9-g)的IC50为7.21±1.72(M)，而父母PC9的IC50为0.37±0.033。还发现PC9-g对奥希替尼的敏感性与PC9相似(IC50:12.3±1.4nMvs.11.2±3.2nM)。尽管PC9-G也怀有同样的E746-A750删除EGFR外显子19H1650，T790MPC9-G检测EGFR外显子20，这被视为原因PC9-G奥希替尼PC9几乎同样敏感，第三代EGFR-TKI，尤其是有效治疗晚期非小细胞肺癌患者T790M。但在我们的研究中，H1650GR中没有检测到T790M，说明奥希替尼在非小细胞肺癌细胞系中，如H1650GR中没有T790M，能够克服gefitinib的获得性抗性，这可能还存在其他的分子机制。

　　Westernblot分析显示，EGFR在H1650GR中的表达显著高于H1650。此外，在H1650中EGFR表达降低，而在H1650GR中EGFR表达显著升高，提示EGFR过表达可能是H1650GR中除EMT外的另一种耐药机制。而10个治疗组通过显著下调EGFR的表达，可有效克服吉非替尼在H1650GR中的获得性耐药。

　　对于A549GR，奥希替尼处理后A549GRp-Akt的难解表达表明，与我们之前和其他研究人员的研究相比，A549GR中除了EMT外，还同时存在多种获得性耐药机制。A549对EGFR-TKIs的主要抗性可能归因于其固有的KRAS突变；也有报道称，该公司与Twist1合作推广EMT。此外，临床研究表明肿瘤中功能性KRAS突变和PI3K/Akt活化共存。本研究结果表明，KRAS突变和p-Akt激活的致癌协同作用也可能在EGFR-TKIs获得性耐药中发挥重要作用，具体机制尚待进一步研究。

　　在已建立的EGFR突变的吉非替尼耐药NSCLC细胞系中也报道了p-Akt的持续激活。与gefitinib敏感的NSCLC细胞系HCC827和PC-9相比，H1650对吉非替尼的主要耐药归因于p-Akt的持续激活。而本研究中奥希替尼与A549GR相比，显著抑制了H1650GR中p-Akt的表达，这可能是奥希替尼除下调EGFR外，在H1650GR中克服gefitinib获得性耐药的另一个重要机制。

　　C797S突变被认为是奥希替尼获得性耐药的主要机制。然而，本研究在H1975AR中未检测到C797S突变或HER2/MET扩增，提示奥希替尼耐药可能存在其他分子机制。另一方面，与H1975相比，H1975AREGFR表达降低，p-Akt表达升高，这与先前建立的奥希替尼耐药H1975的耐药机制一致。有报道称EGFR表达降低的肺癌对BIMBH3模拟药物navitoclax敏感；而上调的BIM作为Bcl-2家族的促凋亡成员，是EGFR-TKIs诱导细胞凋亡所必需的(Huang和Fu2015。有报道称，通过抑制Bcl2和激活半胱天冬酶，ABT-263也能有效克服耐奥希替尼H1975的获得性耐药奥希替尼。这与另一项研究报道的pan-Bcl2抑制剂ABT-737在多西环素诱导Twist1过表达H1975中有效克服奥希替尼的耐药性的结果一致。

　　出乎我们意料的是，与H1650相比，H1650GR在体外不依赖锚点生长实验中显示出显著的致瘤潜力。存在进一步分析表明，CSC生物标志物的重要改变，增加CD24但减少CD133，观察在H1650GR与H1650相比，这对减少CD24，但增加CD133在A549GR显著增强体外与A549肿瘤发生的潜在在我们之前的研究报道。有趣的是，在之前的一项研究中，与H1650相比，已建立的erlotinib耐药H1650ER(H1650ER)在不依赖锚定生长实验中显示出显著的体外致瘤潜力。然而，同样值得注意的是，H1650ER中CD133的表达量远高于H1650。结合本研究中显示的H1975AR中CD133相对于H1975的升高，这些结果可能表明，在体外不依赖于固定物生长的实验中，CD133的表达与体外致瘤潜能呈正相关。更重要的是，比较H1650ER和H1650GR的体外致瘤潜力，在一些EGFR19外显子激活突变的NSCLC患者中，吉非替尼可能比埃罗替尼产生的CSCs要少得多，并且后续治疗奥希替尼更容易控制H1650GR的残留。另一方面，我们的研究表明，H1650GR在体外仍具有明显高于H1650的迁移和侵袭能力，这可能与H1650GR较H1650发生EMT变化有关。

　　我们之前的研究表明，A549GR与A549相比，Twist1表达增加。此外，最近的研究发现Twist1的下调是降低耐药的重要途径。在本研究中，与A549GR和A549GR-ko-c相比，shRNA敲除Twist1显著增加了A549GR-ko-t对吉非替尼或奥希替尼的敏感性。同时我们发现，相对于A549GR和A549GR-ko-c，Twist1的下调逆转了EMT生物标志物vimentin和E-cadherin在A549GR-ko-t中的表达，这可能解释了为什么Twist1的下调降低了EGFR-TKI获得性抗性。有趣的是，相比，A549GR-KO-Tp-Akt显著下调A549GR和A549GR-KO-C在目前的研究中，这表明Twsit1有很大影响的一种蛋白激酶信号通路的激活也报道中扮演重要角色的直接感应EMT和有正相关Twist1表达式在不同类型的癌症。

　　先前的研究表明，吉非替尼在A549GR中的获得性耐药和p-Akt的持续激活归因于EMT，而EMT可能是由TGF-macrophage1诱导的。另一项研究进一步证实了这一假设，该研究发现，Twist1磷酸化介导的PI3K/Akt信号轴与TGF-高表达信号轴相互交叉，上调了TGF-高表达信号轴，导致P13K/Akt过活化，增加了肺转移。这可能进一步解释了为什么我们的研究中Twist1的敲低可以导致A549GR的耐药性降低、EMT逆转以及p-Akt的降低。研究还表明，Twist1与突变的KRAS合作在转基因小鼠模型中诱导肺腺癌，而在KRAS突变的NSCLC细胞系中，Twist1的沉默会导致生长受到显著抑制，并导致KRAS诱导的衰老甚至凋亡。由于KRAS是NSCLC中最常见的突变癌基因之一，在肺腺癌中约有30%的发生率，因此成为NSCLC治疗的一个有吸引力的治疗靶点。然而，目前尚无针对kras突变型NSCLC的靶向治疗获得批准，目前仍在进行临床前研究。因此，开发用于药物应用的Twist1抑制剂可能是一种替代治疗策略，不仅可以治疗kras驱动的肿瘤恶性肿瘤，包括NSCLC，还可以克服与EMT和p-Akt活化相关的耐药性。

　　另一方面，与H1975AR相比，h1975-ko-t中Twist1的敲除并没有降低奥希替尼的获得抗性。考虑到EMT并不是H1975AR相对于H1975的特征性变化，因此，通过抑制Twist1的表达来降低EGFR-TKI抗性可能只对那些EMT较亲本细胞系有明显变化的抗性细胞系有效。由于H1975在基础状态是间质，因此H1975AR获得性对奥希替尼的耐药机制并不依赖于本研究中观察到的twist1介导的EMT过程。先前的一项研究表明，H1975年Twist1过表达可能导致BIM表达的抑制，BIM是Bcl-2家族的一分子，能够促进细胞凋亡，也是EGFRtki诱导细胞凋亡所必需的。然而，结果从同一Yochumetal的研究表明，Twist1击倒并没有提高的敏感性H1975奥希替尼甚至在Bcl2抑制剂abt-737，这可能提供额外的解释在我们的研究中发现，Twist1击倒在H1975AR-KO-T没有减少奥希替尼的获得性耐药。另一方面，与H975不同的是，A549和H1650都是基底状态的上皮细胞，其中Twist1作为上皮标志物E-cadherin的负调控因子。我们之前和目前的研究发现，上调Twist1诱导的EMT赋予了gefitinib在A549GR或H1650GR中的获得性抗性。同样，之前的一项研究报道，Twist1表达的显著增加使得吉非替尼获得性对另一上皮NSCLC细胞系HCC827的抗性，并伴有明显的EMT变化。研究还表明，与HCC827相比，吉非替尼在HCC827GR中并没有降低p-Akt，这表明Akt的持续激活可能是NSCLC中EGFR-TKI获得性耐药的机制。这些结果表明，Twist1抑制在克服获得性抗性中的重要性可能与伴随显著上调的Twist1的EMT进展程度成正比。我们观察到Twist1shRNA质粒转染H1650GR直接杀死H1650GR，与A549到A549GR的EMT变化相比，在E-cadherin、vimentin、Twist1等EMT生物标记物上表现出比H1650更明显的差异，这进一步证明了这一假设。

　　在我们的动物实验中，我们观察到，与A549GR和A549异种移植相比，A549GR-ko-t异种移植在裸鼠中显著延迟了肿瘤的生长。体外不依赖支架生长和transwell侵袭实验显示，A459GR-KO-T的致瘤潜能和侵袭能力明显低于A549GR，这可以解释A549GR-ko-t异种移植体与A549GR异种移植体在体内的肿瘤生长明显滞后的原因。此外，在我们的研究中观察到，A549GR的增殖率低得多的A549体外(数据未显示)，这可能是由于静止的存在和slow-cyclingA549GR干细胞人口和其他类型的耐药癌细胞报道由我们和其他先前的研究。这可能解释了在我们的动物实验中观察到的现象，即细胞注射后A549GR异种移植生长慢于a549-对照异种移植。尽管奥希替尼是第三代EGFR-TKI显示肺EGFR-sensitive患者的有效治疗和耐药突变，它是由我们的动物研究显示，至少减缓肿瘤生长的速度A549-AZD异种移植而A549GR-AZD异种移植治疗的最大奥希替尼填喂法剂量(25毫克/公斤/天)报道。与A549-AZD和A549-AZD移植相比，A549GR-ko-t异种移植瘤的生长速度要慢得多，且A549GR-ko-t对奥希替尼的敏感性明显高于A549GR-ko-t，这可能是导致A549GR-ko-t异种移植瘤显著延迟生长的原因。

　　除了p-Akt和Twist1抑制外，克服其他非t790m介导的耐药机制的最直接策略是EGFR-TKI和抑制耐药机制的分子靶向治疗的结合。其他non-T790M介导耐药机制包括前世见过或HER2基因扩增Takezawaetal，激活等替代旁路通路IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)或NF-kB(核因子kappa轻链剂激活B细胞)，成纤维细胞的生存信号转导，药物渗透不良加上缺氧导致的血管化介导的耐药性差，以及表型变化，如小细胞肺癌(SCLC)转化和EMT。在NSCLC患者中，SCLC转化作为获得性耐药的一种机制，通常采用细胞毒性化疗的SCLC方案进行治疗。crizotinib联合EGFR-TKIs等MET-tkis在经MET基因扩增获得EGFR-TKIs耐药的NSCLC患者中表现出显著反应。然而，在我们的研究中建立的三个抗性细胞系中，没有观察到MET的扩增。其他途径如IGF-1R或NF-kB的激活被认为是可逆的耐药状态，而临床前研究表明，抑制这些途径可以消除持续的耐药细胞或防止获得性EGFR-TKIs耐药。克服EGFR-TKI获得抗病性与可怜的血管化，贝伐单抗的结合(一种抗血管新生单克隆抗体针对血管内皮生长因子(VEGF)与EGFR-TKI埃罗替尼展示了戏剧性的改善无进展生存(PFS)仅比埃罗替尼(16.0个月和9.7个月)在临床的设置。

　　为了克服吉非替尼或厄洛替尼的获得性耐药，除了上述治疗策略外，抗egfr抗体药物如西妥昔单抗联合不可逆EGFR-TKIs如阿法替尼在有或没有T790M的NSCLC患者中显示出了强大的临床活性。奥希替尼（AZD9291）与另一种抗egfr抗体药物necitumumab的联合目前也在进行临床试验。因此，抗egfr抗体药物联合EGFR-TKIs是否会对克服EGFR-TKIs获得性耐药产生协同作用，值得我们在今后的研究中探讨。最近，人们认识到microRNAs(miRNAs)在EMT和/或EGFR-TKI耐药中的重要性及其临床应用潜力。例如，最近的一项研究表明，miRNA-200c的引入显著抑制了吉非替尼耐药HCC4006的细胞活力，EMT特征逆转，表现为vimentin显著下调和E-cadherin上调。然而，细胞存活率。详情请扫码咨询：