T790M突变被认为是对第一代超热生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)如吉非替尼(gefitinib)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者获得性耐药的典型机制，这些患者通常使用EGFR-TKI奥希替尼(osimertinib)进行治疗。然而，对于没有t7.9亿的非小细胞肺癌患者，克服对EGFR-TKIs获得性耐药的治疗策略仍有待确定。在本研究中，将NSCLC细胞株H1650或H1975暴露于浓度逐渐升高的吉非替尼或奥希替尼11个月后产生耐吉非替尼H1650(H1650GR)或耐奥希替尼H1975(H1975AR)。
通过MTT法测定半最大抑菌浓度(ic50)来评价吉非替尼和奥希替尼的体外细胞毒作用。吉非替尼在H1650GR中IC50(50.0±3.0大鼠M)显著高于H1650(31.0±1.0大鼠M)(p<0.05)。奥希替尼在H1975AR组的IC50(10.3±0.9±M)较H1975组(5.5±0.6±M)显著增高(p<0.05)。然而，与H1650相比，奥希替尼在H1650GR上的IC50(8.5±0.5°M)没有增加(9.7±0.7°M)。奥希替尼在A549、H1650和H1650GR中诱导caspase3/7的激活，而在A549GR中没有。
Westernblot分析显示，p-Akt在测定A549、A549GR、H1650和H1650GR对gefitinib或奥希替尼的敏感性中起关键作用。此外，在获得性EGFR-TKI耐药的所有细胞中，我们观察到Twist1表达增加，shRNA敲低Twist1可以通过逆转上皮间质转化(EMT)和下调p-Akt，显著提高A549GR对gefitinib或奥希替尼的敏感性，而H1975AR对奥希替尼的敏感性则没有提高。体外Twist1敲除可增强奥希替尼对A549GR的细胞毒性，而体内研究进一步证实了Twist1敲除可显著延迟A549GR异种移植瘤的生长，且对奥希替尼治疗的裸鼠敏感性增强，未观察到任何毒副反应。
综上所述，我们的研究表明，即使是同样的EGFR-TKI治疗不同的NSCLC细胞系，其获得性耐药机制也可能存在很大差异，这为不同异质性突变状态下获得性EGFR-TKI耐药的NSCLC患者采取不同的治疗策略提供了依据。
非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)激活突变如EGFR-19外显子缺失是第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼临床治疗的良好预测生物标志物。不幸的是，EGFR突变的NSCLC患者在接受吉非替尼治疗10至14个月后病情进展。在非小细胞肺癌患者中，只有一小部分EGFR-tki获得性耐药可归因于EGFR的二次突变T790M的出现，该突变可被第三代EGFR-tki奥希替尼所克服。
对于EGFR-TKI获得性耐药的其他机制，目前尚未明确最佳治疗方法。最近一期i期试验显示，奥希替尼对t790m阴性的NSCLC患者具有一定的疗效，剂量为120mg/d，且有30%的缓解率。这些结果表明奥希替尼可能通过靶向T790M以外的途径克服吉非替尼获得性耐药。
Akt的持续激活是获得性EGFR-TKI耐药的一个显著特征，在获得性EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌患者的大多数临床标本中，p-Akt水平升高。更重要的是，EGFR-tki获得性耐药机制的多样性和不可预测性可能与EGFR突变的NSCLC中Akt通路的聚合激活有关，特异性抑制Akt同时抑制EGFR可以有效克服体内外的获得性耐药。因此，p-Akt的聚合激活可能是一个有价值的治疗靶点或指标，其抑制可能对抗EGFR-TKI获得性耐药的分子异质性。有趣的是，一项研究报告称，不可逆转的表皮生长因子受体抑制剂hki-357，仍然在临床试验正在调查，据报道，或许能绕开吉非替尼的获得性耐药gefitinib-resistantH1650细胞系建立的殖民地选择方法，可以更有效地抑制p-Akt与吉非替尼。
Twist1作为一种转移前因子，在大多数健康的成人组织中被沉默，但在包括非小细胞肺癌在内的各种类型的癌中被发现过表达；通过上皮-间充质转化促进细胞运动、侵袭和耐药性。Twist1的表达被证明可以抑制程序性细胞死亡的进程，还可以通过抑制p53和rb依赖通路来覆盖癌基因诱导的过早衰老。
在原发性和转移性NSCLC中过表达Twist1已被确定为肺癌治疗的一个关键靶点。例如，我们之前的研究表明，在p-4E-BP1高表达的NSCLC患者中，Twist1过表达与生存差相关，沉默Twist1抑制小鼠H1650异种移植瘤的生长。我们还发现，siRNA沉默Twist1可以通过ampk激活的mTOR抑制作用，显著提高NSCLC细胞系A549和H1299对顺铂的敏感性。
最近的一项研究表明，在egfr突变的肺癌细胞中过表达Twist1可导致体内外EGFR-TKI耐药，而通过基因敲低Twist1或harmine抑制Twist1可增强NSCLC细胞株H1650中厄洛替尼的敏感性。最后，Twist1经常与磷酸化肌醇3激酶(PI3K)/Akt的异常过激活有关，这促使我们探索Twist1和PI3K/Akt在克服非小细胞肺癌EGFR-KTI获得性耐药中的内在关系。更重要的是，Twist1下调在克服gefitinib在NSCLC细胞系获得性耐药中的作用尚未见报道。
由于最近的研究显示，非小细胞肺癌患者EGFR-TKI的耐药与个体肿瘤内癌基因突变的异质性密切相关，三个细胞株具有不同EGFR和KRAS突变状态，包括A549，H1650，和H1975，被选出的研究克服gefitnib的获得性耐药的机制或奥希替尼在目前的研究。在我们之前的研究中，建立了抗吉非替尼的A549，而本研究建立了抗吉非替尼的H1650(H1650GR)和抗奥希替尼的H1975。
比较了A549GR和H1650GR对AZ9291处理的响应，并探讨了奥希替尼(泰瑞沙)克服吉非替尼在H1650GR上获得性抗性的机制。因为我们之前和当前的研究表明，过表达Twist1可能发挥重要作用在发展的过程中获得抗病性EGFR-TKI，Twist1击倒效果A549GR或H1975AREGFR-TKI敏感性的进一步研究使用体外和体内模型。详情请扫码咨询：
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