帕博西尼/爱博新的亚细胞分析

　　为了研究帕博西尼(爱博新)的亚细胞定位，我们以具有rb1和p53功能的人黑色素瘤细胞株sk-mel-103为研究对象，将其可逆地保存在酸性囊泡中。这些细胞在dna损伤药物的作用下高效地进行衰老，如博莱霉素、阿霉素、mdm2抑制剂nutlin或帕博西尼(爱博新)。正如预期的那样，这伴随着磷酸化rb1和foxm1的丢失。Foxm1是一个已经确定的cdk4/6磷酸化靶点，在没有cdk4/6活性的情况下非常不稳定。细胞因子的分泌进一步证实了衰老的诱导。值得注意的是，我们使用了1m帕博西尼(爱博新)，这是许多细胞研究的标准，离患者血浆中达到的浓度范围不远(0.2-0.4m）。

　　我们观察到，帕博西尼(爱博新)在405nm光激发下，在中性(7.5)和酸性(4.5)ph条件下，均在500nm处发出强荧光信号。在活细胞中，用同样的激光(405nm)检测帕博西尼(爱博新)荧光，并用500-550nm滤光片收集发射光，在这些条件下，帕博西尼(爱博新)衰老细胞呈现出强荧光信号，而博莱霉素、阿霉素或nutlin(fig。用facs检测到的衰老细胞产生的信号峰值高于其他方法(如阿霉素或博莱霉素)诱导衰老细胞产生的自体荧光特征峰值。这一发现在所有测试的帕博西尼(爱博新)反应细胞，包括黑色素瘤细胞(sk-mel-103)，肝癌细胞(huh7)，肺癌细胞(h226)，以及正常人成纤维细胞(imr90)中观察到。

　　在显微镜下，帕博西尼(爱博新)荧光呈现斑点状核周定位，这使人联想到溶酶体sa-半乳糖活性的定位。事实上，帕博西尼(爱博新)荧光与溶酶体追踪器共定位，这是一种荧光染料，用于标记活细胞中的酸性细胞器。这些观察结果强烈表明，帕博西尼(爱博新)聚集成溶酶体，尽管它们并不排除在其他细胞位置的存在，帕博西尼(爱博新)可以从溶酶体中扩散出来，当药物从细胞外介质中被冲洗出来时，我们量化了在活的衰老的sk-mel-103细胞(用1m帕博西尼(爱博新)处理7天)中的帕博西尼(爱博新)荧光。

　　为了提高检测，细胞暴露于4m帕博西尼(爱博新)的额外处理24小时后，细胞流动与无药物培养基和共聚焦图像，每10分钟采取，量化。实验结果表明，在无药物培养基中，老化细胞的荧光信号逐渐消失。大约4.5h左右，细胞内帕博西尼(爱博新)荧光减少约50%。当每隔1h拍摄图像时，观察到相同的动力学，从而表明荧光信号的减少不是由于激光光漂白。骨肉瘤saos2细胞在rb1基因中有一个纯合子缺失，因此在某种意义上它们对帕博西尼(爱博新)具有抗药性，即它们既不进行细胞周期阻滞也不进行衰老。有趣的是，用帕博西尼(爱博新)处理的saos2细胞也表现出与溶酶体相同的荧光信号，尽管与衰老的sk-mel-103细胞相比，帕博西尼(爱博新)的荧光强度较低。Saos2细胞(~1h~50%)的细胞内荧光较老化的sk-mel-103细胞更快地被去除。

　　我们还观察了衰老的sk-mel-103细胞对帕博西尼(爱博新)的摄取动力学。为此，用1m帕博西尼(爱博新)处理衰老7天的细胞，用含有4m帕博西尼(爱博新)的培养基流动。荧光强度的增加很容易检测到，并在3h后达到一个平台。综上所述，这些观察结果与帕博西尼(爱博新)可逆性进入溶酶体的过程一致，这个过程被称为溶酶体陷阱。这种现象在衰老细胞和非衰老细胞中都有发生，尽管衰老细胞中的白斑数量高于非衰老细胞，这可能是由于衰老细胞溶酶体的特征性大小。

　　帕博西尼(爱博新)对溶酶体功能的短期和长期影响溶酶体内碱性分子的积累可能提高溶酶体的ph值，这可能干扰溶酶体的功能[23]。为了评价帕博西尼(爱博新)对溶酶体室的短期作用，我们用吖啶橙染色细胞。Ao是一种荧光染料，其发射光谱随着ph值的变化而变化:在酸性ph值时，如在功能性溶酶体中，它发出红色信号；在中性ph值时，它发出绿色信号，如在细胞溶胶和细胞核中，它优先染色核仁。正常sk-mel-103细胞中，ao产生一个红色的核周斑点信号和一个微弱的绿色荧光。作为附加对照，我们使用了两种常用于产生溶酶体碱性化的药物，即氯喹和巴菲霉素a1。

　　用氯喹治疗后，核周区域变成橙色，表明中度溶酶体碱化，胞浆产生更强烈的绿色信号。当细胞与巴菲霉素a1共同孵育时，产生强烈的溶酶体碱性化，ao产生包括核周区在内的均匀的泛细胞质绿色信号。与氯喹或巴菲霉素a1相比，即使在高浓度(4m)下使用帕博西尼(爱博新)，在相同时间(1h)内使用帕博西尼(爱博新)并不影响ao的荧光模式，从而表明帕博西尼(爱博新)不能改变溶酶体ph值，即使使用剂量高于治疗水平。

　　为了进一步评估溶酶体的功能，我们测量了lamp-1和p62的水平。Lamp-1是一种与溶酶体膜相关的糖蛋白，通常用作溶酶体含量的指示剂；p62是一种自噬体货物蛋白，在自噬体与溶酶体融合时被降解，因此，p62水平与自噬通量呈负相关。在短时间处理的帕博西尼(爱博新)(24小时)，这些标志物没有进行显着的变化。然而，在细胞衰老的较长疾病潜伏期(7天)后，观察到两种蛋白水平在处理过的帕博西尼(爱博新)细胞中显著升高，提示溶酶体含量增加和自噬通量受损。重要的是，这些变化也观察到处理与其他衰老诱导刺激。

　　因此，溶酶体含量的增加和自噬通量的减少与多种衰老类型有关，并不是帕博西尼(爱博新)诱导衰老所特有的。或溶菌酶。由于帕博西尼(爱博新)被困在溶酶体中，而且在衰老过程中溶酶体区域大大扩张，我们推测衰老细胞可能比对照细胞积累更多的帕博西尼(爱博新)。实际上，衰老细胞在短时间暴露于帕博西尼(爱博新)(分析前1小时)时，其荧光水平明显高于同样暴露于帕博西尼(爱博新)的非衰老细胞。这可能反映了溶酶体腔较大，是衰老细胞的特征。用化合物处理培养细胞时，通常的做法是每隔一天用含药培养基更新培养基，以防止药物衰退。

　　在帕博西尼(爱博新)的例子中，这种做法导致了帕博西尼(爱博新)在sk-mel-103细胞中戏剧性的进行性积累，同时溶酶体腔室平行扩张。有趣的是，连续添加帕博西尼(爱博新)并不影响saos2细胞中帕博西尼(爱博新)的数量，也不产生溶酶体腔的扩张。这表明，与非衰老细胞相比，衰老细胞的溶酶体区间的大小可以根据暴露于帕博西尼(爱博新)而扩大。孟加拉碧康的帕博西尼（爱博新）比原研药便宜很多倍，很多的患者都会选择碧康的帕博西尼。详情请扫码咨询：