维奈托克/威托克和alvocidib联合应用的协同抗白血病活性

　　在AML的体外、体内和体外模型中，观察到维奈托克（威托克）和alvocidib联合应用的协同抗白血病活性，表明无论单药维奈托克（威托克）对患者的敏感性如何，该联合应用都有改善患者预后的潜力。据我们所知，这是首个探索维奈托克（威托克）和alvocidib在AML中的潜在协同作用的报道。考虑到alvocidib和维奈托克（威托克）的临床相关性，以及对AML缺乏有效的治疗选择，我们认为目前的报道不同于以往用CDK抑制剂评估BCL-2抑制剂的报道。

　　在目前的报道中，大多数AML细胞检测到抗凋亡的mcl1下降，而在其他细胞系中观察到促凋亡的bh3蛋白增加，主要是BIM。

　　从一名MDS患者转化为AML的细胞系MOLM-13在被检测的细胞系中是唯一的，因为alvocidib没有降低MCL-1，但与维奈托克（威托克）表现出强烈的协同作用。重要的是，在MOLM-13中观察到所有被测的促凋亡bh3蛋白，包括BIM、PUMA、NOXA和NBK的增加。这表明，就与维奈托克（威托克）协同作用而言，促凋亡BH3-only蛋白的增加在功能上等同于抗凋亡mcl1的减少。

　　已知负调控BIM的多顺反管miR-17-92的MicroRNAs在离体alvocidib处理的细胞中减少，尽管这是否是CDK9抑制的直接或间接结果还需要进一步的实验来确定。对某些细胞系而言，结合维奈托克（威托克）和alvocidib可以增加BH3-only的促凋亡蛋白，超过单剂的增加。因此，除了因维奈托克（威托克）抑制BCL-2而导致的“游离”BH3-only蛋白(s)水平升高(即与抗凋亡蛋白不结合)，以及/或alvocidib降低mcl1蛋白水平外，alvocidib还可能通过增加BIM总蛋白水平和/或其他BH3-only蛋白来诱导细胞凋亡。

　　尽管在我们的AML体外分析的小样本中(n=4)未观察到这种活性。在四个AML患者体外评估样本中，有三个样本的mcl1因alvocidib和/或合并而降低，表明mcl1是分析的原代细胞中的主要机制。

　　完全，体外和体外结果一致显示不同影响bcl-2家族蛋白质尽管类似水平的协同作用，这表明没有影响是绝对与协同本身有关，但职业的整体平衡，抗凋亡蛋白bcl-2家族一直转移的细胞凋亡。先前关于MCL-1的外源性操纵以及MCL-1和BCL-2的双重靶向的报道支持了这一观点，因为它与alvocidib和增强的维奈托克（威托克）活性有关。重要的是，无论是BIMknockdown还是BCL-XL过表达，都不能消除协同作用，这也支持了这一概念，并提供了强有力的功能证据，证明维奈托克（威托克）和alvocidib之间的大多数协同作用是基于内在凋亡途径的聚合机制。更具体地说，虽然BIM混战废除单药维奈托克（威托克）活动，显示趋势变化不显著。

　　表明至少在两个AML细胞株，分析了单维奈托克（威托克）运作很大程度上独立于女子通过经典的位移模型，即bcl-2直接与伯灵顿/负调节MOMPBAK。相反，BIM的knock-down破坏了维奈托克（威托克）和alvocidib之间的大部分协同作用，表明该组合至少部分依赖于直接激活模型，其中BIM作为BAX/BAK的敏化剂和/或激活剂。据我们所知，BIMknock-down的作用之前并没有在拟合并的背景下进行研究，因此通过BIMknock-down来消除协同作用是了解alvocidib和维奈托克（威托克）之间凋亡协同作用机制的一个重要视角。重要的是，通过减少可抑制BAX/BAK的MCL-1，alvocidib降低MCL-1同样可以通过位移模型起作用，通过减少可作为封存BIM和/或其他仅bh3蛋白的储存库的MCL-1，也可以通过直接激活模型起作用。

　　使用多种互补的方法，我们清楚地证明BCL-XL在体外抵消了维奈托克（威托克）/alvocidib的协同作用。BCL-XLHigh细胞的结果与BCL-XL与BCL-2同时作用抑制BAX/BAK和/或隔离BIM/bh3蛋白的模型一致，也与BCL-XL可以抑制alvocidib引起的MCL-1减少和/或bh3蛋白升高的模型一致。考虑到关于BCL-XL的全部体外数据，我们惊奇地观察到体外alvocidib处理样品中BCL-XL蛋白的增加。然而重要的是，在BCL-XLLow细胞中观察到的增加的BCL-XL水平仍然明显低于在BCL-XLHigh细胞中观察到的基线水平，这表明BCL-XL的绝对水平可能是体外反应的一个重要决定因素。在我们对AML患者的体外小样本中，BCL-XL水平与维奈托克（威托克）单药活性或与alvocidib的协同作用没有相关性，这表明BCL-XL可能并不代表该联合治疗AML的临床疗效的主要限制。

　　然而，关于BCL-XL作为体内抵抗机制的几个问题仍然没有答案，如BCL-XL在体外和体内的相对和绝对水平的差异，以及BCL-XL功能的潜在细胞系效应。它还有待确定临床上一些例AMLBCL-XL高表达(推定地红白血病或BCL-XLmegakaryoblastic血统表达式)可能更耐的建议结合维奈托克（威托克）alvocidib，因此受益更多双bcl-2和BCL-XL抑制(即navitoclax/abt-737/abt-263)单独或结合alvocidib。尽管如此，我们的观察结果与最近的报道一致，表明维奈托克（威托克）耐药机制并非普遍存在或相互排斥。

　　通过对维奈托克（威托克）和alvocidib联合治疗后BCL-2家族蛋白的检测，我们惊奇地发现mcl1、BCL-2和BCL-XL均升高。然而，我们在大多数细胞中观察到BIM的相应增加，超出了单药alvocidib的增加，而NOXA在两种单药的组合中观察到增加，在唯一一个我们在同一时间点没有观察到强烈BIM上调的细胞系中。BIM和BCL-2具有相互调节的能力，因此我们推测抗凋亡BCL-2家族蛋白的增加可能是对BIM增加的反应，反之亦然。尽管如此，这里的数据与假设是一致的，即支持和反对凋亡的BCL2家族成员的净平衡决定了总体上固有的凋亡反应，以及提议的联合用药。因此，BH3谱分析作为一种不断发展的检测内在凋亡途径的方法，可能被证明是该方案的一种有用的预测生物标志物。

　　我们发现cdk9选择性抑制与维奈托克（威托克）电位密切相关。而LDC067对维奈托克（威托克）的致敏程度明显降低，尤其是在耐维奈托克（威托克）的细胞中，两者之间存在很强的相关性。我们推测这些区别是由于对CDK9的效力不同，尽管不能排除对其他CDK亚型的抑制。在本研究中我们没有检测CDK9抑制剂dinaciclib，因为之前在弥漫大b细胞淋巴瘤(DLBCL)的研究中有的报道。

　　据报道，无论dinaciclib或维奈托克（威托克）在DLBCL细胞系中的单药效力如何，dinaciclib与alvocidib在DLBCL细胞系中的单药效力如何，联合使用dinaciclib对维奈托克（威托克）也有明显而相似的增强作用。这些观察结果与我们的研究结果一致，表明无论单用维奈托克（威托克）在AML中的活性如何，均具有强大的协同作用。palbociclib对CDK4/6的抑制一般不增强维奈托克（威托克）活性，而在某些AML细胞中具有拮抗作用。虽然我们不能排除CDK9同时抑制CDK4/6导致维奈托克（威托克）致敏的可能性，但这些结果表明palbociclib可能不是AML与维奈托克（威托克）联合的理想选择。seliciclib、NU6102和Ro-3306也观察到强的维奈托克（威托克）增强作用；然而，尽管这些CDK抑制剂不能有效抑制CDK9，但它们可能在引发协同效应所需的相对高剂量下抑制CDK9。

　　在比较等剂量的LY2857785或alvocidib联合维奈托克（威托克）时，两种化合物的最大维奈托克（威托克）折叠致敏效果相似，尽管下一个最近剂量的协同作用对LY2857785更低，特别是对维奈托克（威托克）耐药细胞。BRD4抑制剂JQ1对维奈托克（威托克）的致敏作用类似于alvocidib，提示通过BRD4抑制P-TEFb的功能类似于抑制CDK9。由于JQ1不太可能对CDKs产生脱靶效应，这一间接证据支持了alvocidib主要通过抑制CDK9与维奈托克（威托克）协同的观点。

　　本文提出的功能和机制证据为临床研究联合治疗急性髓性白血病的疗效提供了很强的临床前参考。临床研究表明，在毒性可接受的情况下，alvocidib可安全地加入诱导治疗，因此合用在临床可能可行。然而，alvocidib和近期维奈托克（威托克）和azacitidine联合用药观察到的细胞减少(包括意外血小板减少)，强调了尽可能使用最低剂量的重要性，并强调了我们在此一致证明的低剂量协同作用的重要性。目前正在进行阿伏西迪布与威尼托clax联合治疗AML及高危MDS的临床试验。

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