乐伐替尼/仑伐替尼对细胞的延长处理主要调节结合功能

　　乐伐替尼耐药细胞系的建立

　　为了模拟乐伐替尼的耐药，我们将8505C细胞系在含有25个hw-乐伐替尼的培养基中培养72天。对耐8505C乐伐替尼(8505CRes)细胞株的形态学分析显示，其表型从上皮细胞转变为间质细胞。更重要的是，在治疗结束时，我们检测细胞的凋亡诱导。同剂量的乐伐替尼对8505CRes细胞的诱导凋亡率较亲本8505C细胞更低。我们进一步利用RT-PCR对亲本和抗性细胞系中不同标记的mRNA表达进行了表征。与亲本细胞系相比，耐药细胞中促生存标志物mcll-1、Bcl-2表达明显升高，促凋亡标志物Bax表达降低。此外，我们还观察到PI3K、AKT和mTOR的表达增强伴随着下游分子的激活，如RhoGTPaseeffectorp21activatedkinases(PAKs)，特别是PAK1和PAK4。有趣的是，核出口蛋白XPO1，也被称为染色体区域维持1(CRM1)，被发现在乐伐替尼抗性细胞中被激活。

　　耐乐伐替尼细胞EMT和Stemness标记的分子分析

　　鉴于上皮-间充质转化是干细胞样细胞的固有特性，我们接下来评估间充质耐药细胞中EMT和干细胞标记物的表达。耐药细胞中间充质标记蜗牛(p<0.05)和波形蛋白(Vimentin)的RNA水平显著升高(p<0.01)。在耐药细胞中，经典干细胞标志物ALDH(p<0.01)和Nanog(ns)的RNA水平也被观察到升高。然而，当检测这些间充质和stemness标记的蛋白表达时，与亲本8505C细胞相比，只有Nanog的表达显著升高(增加3.5倍)。Vimentin的表达略有增加，而Snail和ALDH2在亲本细胞系中的表达则低于亲本细胞系。由于上述标记物的RNA和蛋白表达分析结果并不完全一致，因此不能确定耐药细胞中EMT和stemness的出现。

　　亲本和抗性细胞对的转录组分析

　　我们通过RNA-seq分析来评估亲本8505C和耐药细胞的转录变化。分子功能的基因注释分析显示，乐伐替尼（仑伐替尼）对细胞的延长处理主要调节结合功能，包括蛋白、DNA、核苷酸、ATP等结合和催化活性。同样，生物过程的基因注释分析表明，乐伐替尼治疗主要影响代谢过程和生物调控。此外，pathway的基因注释分析显示，共155条通路被调节，包括那些与血管生成、凋亡、细胞周期和炎症相关的通路。此外，符合形态变化，几个EMT标记，如Snail1Snail2和ZEB1发现上调8505cRes细胞(表1)。同时，从表1可以指出，几个致癌基因如CEACAM和NUPR1上调8505cRes甲状腺癌细胞，表明细胞抵抗乐伐替尼治疗。

　　靶向抑制XPO1或PAK4联合乐伐替尼可协同抑制甲状腺癌细胞生长

　　接下来，我们研究了靶向核出口蛋白XPO1和RhoGTPase效应子PAK4单独或联合乐伐替尼对间变性甲状腺癌细胞的影响。XPO1抑制剂KPT-330和KPT-8602以及PAK4-NAMPT双抑制剂KPT-9274可以浓度依赖性地抑制8505C细胞的增殖。这些化合物的IC50s在低纳摩尔范围内(从23.52nM到112.1nM)。此外，我们通过PAK1抑制剂IPA-3处理8505C细胞，评估了对间变性甲状腺癌细胞抑制PAK1的效果。有趣的是，在测试浓度下，PAK1抑制没有表现出任何细胞生长抑制。

　　接下来，我们评估了这些抑制剂与乐伐替尼（仑伐替尼）联合治疗对8505C细胞增殖的影响。联合处理可协同抑制8505C细胞增殖。等波图分析进一步显示，KPT-330+乐伐替尼在所有被测剂量组合中的联合指标值均小于1(CI<1)，表明协同效应。此外，KPT-8602+乐伐替尼和KPT-9274+乐伐替尼除了一个剂量组合外，在所有剂量组合中也观察到协同作用(CI<1)。这些结果表明，靶向抑制RhoGTPaseeffector或核出口蛋白可使甲状腺癌细胞对乐伐替尼治疗敏感。此外，当PAK1抑制剂IPA-3联合乐伐替尼对8505C细胞生长的影响进行评估时，未观察到协同抑制。由于IPA-3选择性地抑制PAK1，而不会引起II组PAKs(包括PAK4)的抑制，这些结果表明，虽然靶向间变性甲状腺癌细胞中的PAK4是一个可行的选择，但靶向PAK1则不是。

　　XPO1或PAK4抑制可使皮下移植的甲状腺癌对乐伐替尼敏感

　　受协同分析结果的鼓舞，我们接下来评估了乐伐替尼（仑伐替尼）与KPT-9274或临床级KPT-330(XPOVIO片剂含有口服KPT-330作为活性成分)联合治疗从8505C细胞发展的皮下移植瘤的影响。乐伐替尼口服50mg，每天两次，每周5天，连续三周，对肿瘤生长的影响极小。但口服KPT-330，每周2次，每次10mg/kg，连续3周，可显著抑制8505C异种移植物的生长(p<0.05)。给予KPT-9274，每天两次，每周5天，每次100mg/kg，连续3周，肿瘤症状轻微减轻。值得注意的是，与单药治疗相比，KPT-330和KPT-9274联合乐伐替尼可以更大程度地降低肿瘤生长。在治疗过程中，小鼠的体重没有明显下降。

　　与单药乐伐替尼相比，KPT-330+乐伐替尼组肿瘤总重有统计学意义。此外，乐伐替尼与KPT-330或KPT-9274联合使用可显著降低肿瘤组织中ki67增殖标记物。我们还评估了Vimentin在治疗后基因表达的变化。与单药治疗相比，乐伐替尼联合KPT-330或KPT-9274对EMT标志物Vimentin的抑制作用更强。这些结果支持使用KPT-330或KPT-9274作为单一药物或联合乐伐替尼治疗耐药的甲状腺癌。乐伐替尼怎么购买？康安途可以买到吗？详情请扫码咨询：