乐伐替尼通过VEGFR抑制肿瘤

　　乐伐替尼联合everolimus在人肾细胞癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤活性

　　我们首先评估了乐伐替尼和everolimus作为单方和联合用药在三种人类RCC异种移植(A‐498，Caki‐1和Caki‐2)小鼠模型中的抗肿瘤活性。RCC细胞接种后，当肿瘤大小达到200-350mm3(第1天)时，随机分为4组，每个异种移植模型。小鼠仅给予溶剂，10mg/kg的乐伐替尼，30mg/kg的everolimus，或乐伐替尼(10mg/kg)+everolimus(30mg/kg)口服14天。在所有三种RCC移植瘤模型中，与仅使用vehicle的对照组相比，每种单一疗法在第15天均显示肿瘤生长受到抑制。与单药治疗相比，乐伐替尼+everolimus在所有三种模型中对肿瘤生长的抑制作用显著增强，并导致A‐498和Caki‐1模型中的肿瘤回归。与单药乐伐替尼或everolimus相比，联合治疗耐受性良好，且不会导致体重减轻增加。

　　乐伐替尼联合everolimus在人肾细胞癌异种移植模型中的抗血管生成活性

　　接下来，我们在A‐498和Caki‐1模型中研究了乐伐替尼、everolimus以及联合用药对肿瘤血管生成的抑制作用，在这些模型中，联合用药会导致肿瘤消退。通过抗CD31抗体染色后测量MVD来评估肿瘤血管生成。乐伐替尼单药治疗明显降低了A‐498异种移植物的MVD，而everolimus单药治疗没有。此外，接受乐伐替尼+everolimus联合治疗的携带‐498异种移植物的小鼠的MVD与接受乐伐替尼单药治疗的小鼠相当。提示主要是乐伐替尼抑制血管生成。这一结果得到了基因表达分析数据的支持，其中，在A‐498异种移植中，与血管生成相关的小鼠基因主要通过乐伐替尼单药治疗和联合治疗下调。此外，乐伐替尼在A‐498异种移植物中诱导的抗血管生成作用与组织缺氧有关。在Caki‐1模型中，与对照组相比，乐伐替尼或everolimus单药治疗均显著降低MVD，并且乐伐替尼与everolimus联合治疗的MVD降幅大于单药治疗。

　　乐伐替尼和everolimus在A‐498和Caki‐1细胞中的抗增殖活性

　　为了检查乐伐替尼和everolimus是否对A‐498和Caki‐1细胞具有抗增殖活性，我们进行了体外增殖试验。细胞暴露于每种药物6天，然后测定存活细胞的相对数量。在A‐498和Caki‐1细胞中，伊维莫司的IC50值分别为5.46nmol/L(95%可信区间为1.73-17.2)和21.0nmol/L(95%可信区间为4.34-102)，而乐伐替尼的IC50值在两种细胞系中均为>5mol/L。这些结果表明，伊维莫司(而不是乐伐替尼)能够有效地抑制这些RCC细胞系的增殖。体外观察到的伊维莫司的抗增殖作用与数据一致，即在‐498异种移植模型中，伊维莫司单药治疗下调了细胞周期相关基因。

　　乐伐替尼+everolimus对VEGF诱导的HUVECs细胞内信号转导和细胞增殖的影响

　　然后我们研究了乐伐替尼和everolimus联合治疗对体外内皮细胞VEGF刺激细胞功能的影响。为了阐明这些化合物对细胞内信号转导的影响，我们进行了Westernblot分析来评估Erk1/2、S6K和S6的活性。与预期的一样，乐伐替尼通过抑制VEGFR抑制Erk1/2、S6K(Thr389和Thr421/Ser424)和S6(Ser235/Ser236)的磷酸化。相比之下，伊维莫司抑制了S6K(Thr389和Thr421/Ser424)和S6(Ser235/Ser236)的磷酸化，但不抑制Erk1/2的磷酸化。乐伐替尼和everolimus联合抑制了MAPK和mTOR通路。值得注意的是，联合治疗对S6K(Thr421/Ser424)和S6(Ser235/Ser236)磷酸化的抑制作用大于单一治疗。乐伐替尼联合伊维莫司明显不能增强S6K(Thr389)磷酸化抑制，这可能反映了伊维莫司单药治疗完全抑制了S6K(Thr389)磷酸化。

　　接下来，我们使用中值效应法评估乐伐替尼和everolimus对VEGF驱动的HUVECs增殖的联合作用。所有治疗均以剂量依赖性的方式抑制VEGF诱导的HUVECs增殖。四种剂量比(乐伐替尼:everolimus，2.5:1，5:1，10:1，和20:1)的CI值在0.80到1.17之间，表明联合治疗导致的主要是加性相互作用。

　　乐伐替尼+everolimus对FGF诱导的细胞内信号通路和HUVECs试管形成的影响

　　成纤维细胞生长因子是另一种与肿瘤生长相关的强有力的促血管生成因子，包括在肾细胞癌中，我们发现FGF在我们检测的三种肾细胞癌细胞系中表达。由于乐伐替尼在体内同时抑制VEGF和FGF诱导的血管生成，6我们评估了乐伐替尼联合依维莫司对FGF诱导的血管生成的影响。与HUVECs中对VEGF刺激信号通路的影响相似，Westernblot分析显示，乐伐替尼单药治疗抑制了bFGF‐刺激的HUVECs中的MAPK和mTOR通路，而everolimus单药治疗仅抑制了mTOR通路。然而，乐伐替尼和everolimus联合使用比单独使用更能抑制S6K(Thr421/Ser424)和S6(Ser235/Ser236)磷酸化。

　　测定了bFGF诱导成管试验的组合指数值。在这些实验中，研究了HUVECs(对bFGF的反应)在含有基底膜提取物的凝胶上形成毛细管样结构能力的药物效应。28乐伐替尼、everolimus和联合剂量依赖性地抑制管的形成，并且联合治疗的抑制作用大于单一治疗。乐伐替尼:everolimus、1:4、1:8、1:12、1:16四种剂量比的CI值在0.47~0.74之间，说明这主要是协同作用。

　　FGFR抑制剂在Caki‐1异种移植物RCC小鼠模型中的抗肿瘤和抗血管生成活性

　　在Caki‐1异种移植小鼠模型的MVD检测中，乐伐替尼联合everolimus增强了抗血管生成作用；因此，我们使用FGFR选择性抑制剂PD173074检测FGF信号是否在该模型中影响肿瘤生长和血管生成。29例PD173074(50mg/kg)治疗后第15天肿瘤体积明显小于对照组。此外，与车辆控制相比，PD173074处理后MVD也有所下降。综上所述，这些结果表明FGF驱动的肿瘤血管生成可能促进Caki‐1肿瘤的生长。

　　乐伐替尼和everolimus在体外可协同抑制VEGF‐或FGF‐诱导的HUVECs增殖和管状形成。为了进一步在体内检验这些效应，我们使用了VEGF‐或FGF‐诱导的血管生成支持肿瘤生长的KP‐1转染小鼠模型。将6个KP‐1转染剂接种到小鼠体内，当其肿瘤大小达到约300mm3(第1天)时，每个异种移植模型的小鼠随机分为6组。

　　小鼠随后接受乐伐替尼单药治疗、依维莫司单药治疗或联合用药14天(KP‐1/VEGF)或10天(KP‐1/FGF)。与对照组相比，7.5mg/kg的乐伐替尼单药治疗和15mg/kg的everolimus单药治疗明显抑制了肿瘤的生长。此外，乐伐替尼(7.5mg/kg)联合依维莫司(15mg/kg)的抗肿瘤活性明显高于相同和更高剂量的单药治疗。与RCC异种移植小鼠模型一样，联合治疗具有良好的耐受性，并没有比单一治疗造成更大的体重减轻。这些结果表明，乐伐替尼和everolimus联合治疗可增强依赖于VEGF‐或FGF‐诱导的血管生成的肿瘤生长的抗肿瘤活性。康安途可以为患者提供各类的靶向治疗药物的购买途径，详情请扫码咨询：