乐伐替尼/仑伐替尼可以抑制RET靶点吗

　　乐伐替尼对肝癌细胞系的抗增殖活性

　　FGF信号通路的激活与HCC的进展有关，而HCC亚群的增殖依赖于FGF信号通路。因为乐伐替尼可以抑制FGFRs，所以我们首先在体外检测了乐伐替尼对9个肝癌细胞系的抗增殖活性。免疫印迹分析表明，FGF19FGFR4，和β克罗索是这三个细胞系中高度表达，表明FGF19-FGFR4轴被激活，与先前的报道一致，26岁。乐伐替尼也对SNU‐398、Li‐7和HuH‐1细胞的增殖表现出中度抑制作用，IC50值分别为1.56、1.65和2.59mol/L。尽管FGF19蛋白未表达，但在这些细胞中检测到了一些FGFR家族成员。因为这些细胞系对泛‐FGFR抑制剂(如BGJ39820、21、26)中度敏感，乐伐替尼可能通过靶向激活的FGF信号通路抑制细胞增殖。乐伐替尼对SK‐HEP‐1、SNU‐449或PLC/PRF/5细胞没有明显的抗增殖活性(IC50>5mol/L)，它们对pan‐FGFR抑制剂也不敏感。

　　作为参考，我们还检测了已获批的用于uHCC427的全身治疗药物索拉非尼(sorafenib)在9个肝癌细胞系中的抗增殖活性。索拉非尼对高表达FGF19的肝癌细胞系没有选择性的抗增殖活性。这些结果表明，乐伐替尼(仑伐替尼)选择性地通过激活的FGF信号通路抑制肝癌细胞的增殖。

　　乐伐替尼与受体酪氨酸激酶VEGFR2结合，结合模式为V型28；这可能有助于其高亲和力和选择性受体酪氨酸激酶的少数。使用乐伐替尼-FGFR1复合物的Co-crystal分析显示，乐伐替尼也以V型结合模式结合FGFR1。基于乐伐替尼-FGFR1复合物的同源建模和对接模拟表明，与FGFR2、3和4的结合模式与FGFR1是相同的。乐伐替尼拥有多个靶点：VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FGFR1、PDGFR、cKit、Ret。

　　乐伐替尼对肝癌细胞系FGF信号通路的抑制作用

　　接下来我们通过Westernblot分析乐伐替尼对肝癌细胞系FGF信号通路的影响。在高表达FGF19的Hep3B2.1‐7和HuH‐7细胞中，观察到FGFR下游信号分子FRS2的结构性磷酸化；在Hep3B2.1‐7细胞中，重组人FGF19的加入进一步增强了这种磷酸化。乐伐替尼在两种细胞中均抑制FRS2在0.03-3mol/L的磷酸化。乐伐替尼在增殖实验中对这些细胞的IC50值与乐伐替尼抑制pFRS2的浓度平行。此外，乐伐替尼剂量依赖地抑制SNU‐398细胞中FRS2的磷酸化。乐伐替尼抑制的基本FGF(bFGF)刺激应承担的磷酸化FRS2449年SNU检测细胞，表达高水平的FGFR1，尽管乐伐替尼并未显示强力的抗增殖活性与细胞。相比之下，索拉非尼并没有显示出明显的抑制FRS2磷酸化在肝癌细胞株进行测试。这些结果表明，乐伐替尼介导的对HCC细胞中FGF信号通路激活的FGFRs的阻断可能是该化合物体外抗增殖活性的基础。

　　乐伐替尼对FGF信号通路激活的异种移植瘤模型的抗肿瘤活性

　　接下来，我们在Hep3B2.1‐7和SNU‐398模型中评估了乐伐替尼对具有激活FGF信号通路的肝癌异种移植物的体内抗肿瘤活性。体内异种移植肿瘤的生长明显抑制由乐伐替尼剂量Hep3B2.13-30毫克/公斤的高7模型和1030毫克/公斤398年SNU检测模型，和索拉非尼在10和30毫克/公斤Hep3B2.17模型和30毫克/公斤398年SNU检测模型。治疗组的BWL是类似于相应的车辆对照组，虽然在每个恶病质观察诱导BWL应承担的对照组。

　　为了检测乐伐替尼是否抑制Hep3B2.1‐7和SNU‐398移植瘤中的FGF信号通路，在单一乐伐替尼治疗2小时后收集肿瘤样本，并评估FRS2和另一个下游FGFR分子Erk1/2的磷酸化水平。在Hep3B2.1‐7模型中，10和30mg/kg的乐伐替尼抑制FRS2和Erk1/2的磷酸化；在SNU‐398模型中，3-30mg/kg的乐伐替尼抑制FRS2磷酸化；在SNU‐398模型中，30mg/kg的乐伐替尼(仑伐替尼)抑制Erk1/2磷酸化。相比之下，在两种模型中，索拉非尼治疗的移植瘤均未观察到明显抑制。在体内过表达FGF19的人HCCHuH‐7移植瘤中也观察到FGF信号通路的抑制。这些结果表明，靶向FGFR的HCC细胞是乐伐替尼在具有激活的FGF信号通路的临床前HCC模型中的抗肿瘤活性的基础。

　　乐伐替尼对PLC/PRF/5移植瘤模型的抗肿瘤活性

　　与Hep3B2.1‐7、HuH‐7和SNU‐398细胞相比，体外实验中PLC/PRF/5细胞对乐伐替尼和其他FGFR抑制剂20、26不敏感，且不过表达FGF19，尽管FGFR4表达了，这表明PLC/PRF/5细胞的增殖不依赖于激活的FGF信号通路。乐伐替尼在所有剂量下都能抑制PLC/PRF/5移植瘤的体内肿瘤生长，索拉非尼在30mg/kg时也能抑制体内肿瘤生长。与相应的对照组相比，两个治疗组均未发现明显的BWL。在另一个实验中，在PLC/PRF/5模型中，乐伐替尼的最大抗肿瘤活性大于sorafenib。为了检验乐伐替尼和索拉非尼对PLC/PRF/5移植瘤的抗肿瘤活性是否基于血管生成抑制，我们测量了PLC/PRF/5移植瘤中的MVD。按照抗肿瘤活性、肿瘤MVD明显减少了乐伐替尼治疗后第8天3-30毫克/公斤，索拉非尼治疗30毫克/公斤。这些结果表明，乐伐替尼可以发挥抗肿瘤活性对肝癌肿瘤的扩散并不依赖FGF信号通路，通过其抗血管生成效应。

　　在接受乐伐替尼和索拉非尼治疗后，我们还测量了Hep3B2.1‐7和SNU‐398异种移植模型的MVD。乐伐替尼(Hep3B2.1‐7模型3-30mg/kg；10和30毫克/公斤SNU398模型)和索拉非尼两种模型(30毫克/公斤)显著降低MVD在异种移植肿瘤，这表明乐伐替尼可能目标FGFR临床肝癌HCC细胞和肿瘤血管生成的模型与激活FGF信号通路，而索拉非尼的目标主要是肿瘤血管生成或未定义的信号通路。

　　乐伐替尼在患者源性异种移植(PDX)源性细胞系的异种移植模型和两个HCCPDX模型中的抗肿瘤活性

　　我们使用PDX‐来源的异种移植物模型和两个HCCPDX模型检测了乐伐替尼(仑伐替尼)的抗肿瘤活性。PDXLIX‐012虽然不具有FGF19基因扩增，但明显表达FGF19。由PDXLIX‐01229建立的LIXC‐012细胞系，过表达FGF19、FGFR4和KLB，并对FGFR4选择性抑制剂BLU9931敏感，表明FGF19‐激活的FGF信号在LIXC‐012模型中起作用。

　　这里，3-30mg/kg的乐伐替尼和30mg/kg的索拉非尼抑制了LIXC‐012异种移植瘤的体内生长。在该模型中观察到恶病质诱导的BWL，但乐伐替尼以10mg/kg和30mg/kg剂量治疗的小鼠BWL出现恢复。为了检查乐伐替尼是否在体内抑制LIXC‐012细胞的增殖，我们在最后一次乐伐替尼剂量后1天在移植瘤中对增殖标记Ki‐67进行染色。3-30mg/kg的乐伐替尼处理显著减少Ki‐67阳性细胞的数量。索拉非尼仅以30mg/kg浓度处理Ki‐67时，观察到明显而适度的抑制。

　　我们还检测了乐伐替尼对两个HCCPDX模型LI0050和LI0334的肿瘤生长抑制作用。乐伐替尼10和30毫克/公斤pdx抑制了肿瘤的生长，这是伴随着一个戏剧性的和MVD明显下降。索拉非尼30毫克/公斤不是容忍LI0050模型中，未能显示抗肿瘤和抗血管生成活动LI0334模型。在这两个模型，BWL乐伐替尼治疗组相媲美，在对照组。这些结果表明，乐伐替尼(仑伐替尼)对HCCPDX模型具有抗肿瘤活性，可能是通过其强大的抗血管生成活性。总的来说，乐伐替尼的抗肿瘤活性在多种临床前HCC模型中都比索拉非尼更强，包括细胞系移植和PDX模型。

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