先锋因子GATA2在全球范围内控制恩杂鲁胺/安杂鲁胺诱导的转录

　　我们接下来研究了恩杂鲁胺（安杂鲁胺）配体 AR 调节NR3C1和SLC7A11的潜在机制。鉴于先驱转录因子GATA2和FOXA1影响的DHT应答基因AR调节，以及GATA2和FOXA1结合到恩杂鲁胺响应AR的位置，我们进行了ChIP实验，以确认GATA2 或 FOXA1 与NR3C1和SLC7A1增强子的结合。GATA2 和 FOXA1 在这两个增强子区域均富集，恩杂鲁胺治疗进一步增强了这两个先锋因子的募集。为了研究 GATA2 或 FOXA1 的结合是否调节NR3C1和SLC7A11，我们敲低了GATA2或FOXA1，然后在用或不用恩杂鲁胺处理 4 小时和 24 小时的 LNCaP 细胞中对这两个基因进行 RT-PCR 分析。通过 RT-PCR 和蛋白质印迹分析证实了 siRNA 敲低效率。GATA2沉默在 4 小时和 24 小时的时间点均一致且显着地抑制了恩杂鲁胺诱导的NR3C1和SLC7A11 的表达。相比之下，FOXA1敲低在不同时间点以基因特异性方式增强或抑制恩杂鲁胺刺激的表达。这与报道的 FOXA1 在雄激素反应基因调控中的复杂作用一致。这些数据表明 GATA2 在介导恩杂鲁胺对NR3C1和SLC7A11的激活中起普遍作用。

　　为了解决 GATA2 调节恩杂鲁胺诱导转录的潜在机制，我们进行了 ChIP 分析以研究GATA2沉默对 AR 和 Pol II 募集到NR3C1和SLC7A11 的调节区域的影响。在存在恩杂鲁胺的情况下，与 siControl 相比，在 siGATA2 转染细胞中，AR 向增强子的募集和 Pol II 向启动子的募集显着减少。这些数据表明，恩杂鲁胺诱导的 AR 和 Pol II 募集到NR3C1和SLC7A11位点需要 GATA2。

　　为了研究 GATA2 是否全局调节恩杂鲁胺诱导的转录，在用 25 μM 恩杂鲁胺或载体处理 24 小时的 siControl 或 siGATA2 转染的 LNCaP 细胞中进行了 RNA-seq 分析。有趣的是，我们发现绝大多数 (94.04%) 恩杂鲁胺 上调基因被 GATA2 敲低下调，表明 GATA2 指导恩杂鲁胺诱导的全局转录激活。恩杂鲁胺配体 AR 结合位置和恩杂鲁胺/GATA2 调节基因的进一步综合分析显示，恩杂鲁胺配体 AR 结合位置位于这些基因的非启动子区域。为了验证我们的全局分析，应用 RT-PCR 分析了 4 个新的恩杂鲁胺调节基因（TSC22D3、LAMP3、VEGFA和CEMIP）。

　　这四个基因中的每一个的表达都被恩杂鲁胺而不是 DHT 上调，并且 GATA2 沉默显着降低了恩杂鲁胺刺激的表达。此外，在 GATA2 敲低后，恩杂鲁胺刺激 GATA2 和 AR 与这四种基因的远端调节区的结合受到显着抑制。总之，这些结果表明 GATA2 控制着恩杂鲁胺诱导的全局转录。最后，我们检查了我们新发现的恩杂鲁胺激活基因NR3C1、SLC7A11、TSC22D3、LAMP3、VEGFA和CEMIP 的功能意义.这些基因中的每一个的沉默显着增强了恩杂鲁胺的细胞生长抑制作用，表明这些基因的表达损害了恩杂鲁胺抑制前列腺癌生长的能力。

　　鉴于转录共激活因子在雄激素诱导的转录中发挥重要作用 ，我们接下来询问共激活因子是否参与恩杂鲁胺调节的转录。我们以前的研究发现，共激活因子MED1，一个进化上保守的多蛋白复合物（约30个亚基）的一个亚基称中保，是在前列腺癌细胞中雄激素调节转录（必要的）。因此，我们检查了 MED1 在恩杂鲁胺诱导的NR3C1、SLC7A11、TSC22D3、LAMP3、VEGFA和CEMIP 激活中的作用。鉴于 MED14 亚基最近被确定为 Mediator 复合体的结构和功能骨架。我们还研究了 MED14 是否参与恩杂鲁胺刺激的转录。MED1或MED14siRNA 转染后 48 小时，用恩杂鲁胺处理细胞 4 小时或 24 小时。在 4 小时和/或 24 小时时间点，MED1 或MED14 的沉默显着降低了恩杂鲁胺诱导的六种基因的转录，表明 MED1 和 MED14 共同激活恩杂鲁胺刺激的转录。由于据报道 GATA2 将 MED1 募集到一些雄激素反应基因的调节区域，我们接下来检查了 GATA2 是否有助于将 MED1 和 MED14 募集到NR3C1和SLC7A11的增强子。GATA2沉默显着减弱了恩杂鲁胺刺激的 MED1 和 MED14 与这两种增强子的结合不影响 MED1 或 MED14 蛋白表达水平。这些数据表明 GATA2 指导 MED1 和 MED14 共同激活恩杂鲁胺刺激的转录。与已知的 Mediator 促进 Pol II 募集到转录前启动复合物 (PIC)的作用一致，我们的结果还表明 GATA2 指导 Pol II 结合通过招募 MED1 和 MED14。现在恩杂鲁胺的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。