曲美替尼(Trametinib)联合或不联合维罗非尼治疗BRAF突变肺癌

　　V-Raf 鼠肉瘤病毒致癌基因同源物 B (BRAF) 突变的肺癌具有相对侵袭性，并且对目前可用的疗法具有抗性。在最近一项针对 BRAF-V600E 非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的 II 期研究中，BRAF V600E 抑制剂显示出活性证据，但该选定组中有 30% 在治疗期间出现进展，这表明需要制定替代策略。我们测试了两种不同的选择，以提高 vemurafenib（BRAF V600E 抑制剂）在 BRAF 突变 NSCLC 中的疗效。第一个选择是将厄洛替尼添加到威罗菲尼中，以观察该组合是否提供协同作用。第二种是用曲美替尼（MEK 抑制剂）诱导 MEK 抑制（RAF 的下游）。我们发现威罗非尼和厄洛替尼的组合对 BRAF-V600E 细胞中 p-ERK 信号的抑制没有协同作用。威罗菲尼在 BRAF-V600 细胞中引起显着的细胞凋亡、G1 期阻滞和 BIM 上调。曲美替尼（Trametinib）作为单一药物在 BRAF 突变细胞（V600E 或非 V600E）中是有效的。最后，与任一单一药物相比，威罗非尼和曲美替尼的组合导致细胞凋亡小幅但显着增加以及 BIM 的显着上调。因此，暗示了使用组合方法管理这组患者的可能性。重要的是，单独使用曲美替尼导致 BRAF 非 V600 突变细胞中 p-AKT 的上调，而这种效果在组合中无效。

　　我们还着手确定 MEK 抑制剂曲美替尼是否会使 BRAF 突变的野生型 (WT) EGFR NSCLC 细胞对威罗菲尼的 BRAF 抑制敏感。我们假设 BRAF-V600E 细胞对 BRAF 抑制剂的敏感性有限，因为 MAPK 通路被激活。因此，曲美替尼可以增强 BRAF 抑制剂在 BRAF 突变的 NSCLC 中的疗效。对 BRAF 抑制剂的抗性是通过多种机制介导 MAPK 通路重新激活。Trametinib 靶向 MEK，它位于 MAPK 通路中 BRAF 的下游。因此，将曲美替尼与 BRAF 抑制剂（威罗非尼或达拉非尼）联合使用会更有效。我们的目的是研究曲美替尼和维罗非尼是否可以合作抑制 BRAF 突变 NSCLC 细胞系中的 ERK/MAPK 信号通路。我们在 BRAF 突变的 NSCLC 细胞系 HCC364 [V600E-BRAF，WT EGFR] 和 H1755 [非 V600E，G469A BRAF 突变体，WT EGFR ]。

　　曲美替尼（Trametinib）和维罗非尼联合治疗的效果。MEK 抑制剂和 BRAF 抑制剂的联合治疗对具有 BRAF-V600 突变的晚期黑色素瘤有效，但尚未在 BRAF 突变的 NSCLC 中探索 MEK 抑制剂或这种类似组合的效果。我们分析了在 vemurafenib 中加入曲美替尼是否会在 BRAF 突变细胞 H1755 和 HCC364 中显示出任何功效。与威罗菲尼相比，曲美替尼在两种细胞系中抑制 7 天后的生长更有效，但是两种药物的组合与单独使用曲美替尼没有显着差异。我们评估了两种 BRAF 突变 NSCLC 细胞在用 DMSO、维罗非尼、曲美替尼和联合治疗 24 小时后细胞周期的差异。与 DMSO 治疗相比，威罗非尼和曲美替尼均能有效引起 G1 期阻滞，这可以通过 G1 期显着增加和 S 期细胞减少来证明。然而，这种组合并不比单独使用任何一种药物更有效。在用相应试剂处理 24 小时后，通过细胞周期蛋白的免疫印迹分析证实了在 HCC364 细胞中用流式细胞术观察到的细胞周期停滞。与 DMSO 相比，vemurfenib、trametinib 及其组合显示 CDK2 下调，p21 和 p27 上调。然而，在用曲美替尼、威罗菲尼或曲美替尼加威罗菲尼联合治疗的细胞中，这些细胞中 CDK2、p21 或 p27 的表达没有差异。此外，我们没有观察到 pJAK2 和 pSTAT3 表达的任何差异。有趣的是，尽管流式细胞术观察到 G1 停滞和 S 期减少，但 H1755 细胞在 CDK2 或 p21 和 p27 中没有表现出类似的趋势。这使我们相信 G1 期阻滞涉及另一种机制，它与这些细胞中的 CDK2 下调无关。

　　我们进一步探讨了威罗非尼和曲美替尼组合在 BRAF 突变的 NSCLC 细胞中的凋亡作用。Trametinib 在两种 BRAF 突变细胞系中诱导细胞凋亡。在 HCC364 和 H1755 中，vemurafenib 和trametinib 的组合引起的细胞凋亡显着高于单药。通过 HCC364 细胞中 PARP 裂解的存在证实了不同剂量曲美替尼治疗后的细胞凋亡，而在没有裂解 PARP 的 H1755 细胞中观察到 PARP 减少。用曲美替尼治疗后，HCC364 和 H1755 细胞中促凋亡蛋白 BIM 的上调进一步支持细胞凋亡的发生。与单独使用曲美替尼相比，该组合导致 BIM 的更大增加。这一观察结果表明，在 BRAF 突变细胞中，威罗非尼和曲美替尼的组合在促进细胞凋亡方面比单独使用曲美替尼更好。BCL-2、BCL-xl、MCL-1、BAX 和 BAK 的表达未观察到显着变化。

　　曲美替尼（Trametinib）作为单药治疗 BRAF 突变的 NSCLC。MEK 抑制剂司美他尼在 KRAS 突变的 NSCLC 的临床前肺模型中显示出下调 ERK 信号传导，但在 BRAF 突变的 NSCLC 中尚未证明类似的效果。我们想比较在 BRAF 突变的 NSCLC 中引入 BRAF 抑制剂、MEK 抑制剂或两者组合导致的致癌信号改变。通过进行免疫印迹分析来评估致癌信号的变化，以评估在用 1 μM 剂量的单一药剂和 1:1 的组合比例处理 48 小时时，使用 vemurafenib、trametinib 和组合的两种细胞中细胞凋亡信号的变化，每个剂量为 1:1μM。我们观察到，在 HCC364 和 H1755 细胞中，与单独使用 DMSO 或 vemurafenib 相比，用曲美替尼治疗导致 ERK 磷酸化的显着抑制。。曲美替尼和威罗非尼的组合并不比单独使用曲美替尼更好。此外，我们注意到，无论是使用单一药物还是联合用药，HCC364 细胞中的 pAKT 都没有升高（在 HCC364 细胞中微弱地检测到 p-AKT，并且表达没有改变——未显示免疫印迹）。然而，我们看到在非 V600E BRAF 突变的 H1755 细胞中使用单一药物曲美替尼时 p-AKT 表达增加，有趣的是，与 DMSO 相比，曲美替尼和威罗菲尼的组合并未显示 p-AKT 增加，这表明或许 p-AKT 通路可能在对单药曲美替尼治疗的耐药性中起作用。曲美替尼（Trametinib）也能有效引起 HCC364 和 H1755 细胞凋亡。此外，曲美替尼还在两种 BRAF 突变细胞中引起 G1 期阻滞。尽管细胞周期蛋白的变化、CDK2 的下调和 p21 和 p27 表达的上调，仅在 HCC364 细胞中观察到。

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