奥希替尼/泰瑞沙对EGFRm肺癌细胞株糖酵解代谢的影响

　　以往的研究表明，通过特异性小分子抑制剂抑制显性激酶致癌基因可以减弱糖酵解作用。我们希望评估奥希替尼对EGFRm肺癌细胞株糖酵解代谢的影响。在egfr突变株NCI-H1975和PC9中，奥希替尼降低了乳酸产量——糖酵解的标志，而在egfr野生型NCI-H460中，奥希替尼没有影响乳酸产量。这种作用是EGFR特异性的，因为吉非替尼可抑制PC9细胞的糖酵解，但对EGFR活性保持不变的耐药T790M+NCI-H1975细胞无效。奥希替尼抑制乳酸分泌一组扩展的EGFRm行，除了NCI-H1650细胞，本质上是对表皮生长因子受体抑制剂包括奥希替尼，只有适度抑制S6磷酸化在回应奥希替尼尽管EGFR抑制。　　

　　总的来说，糖酵解抑制和奥希替尼IC50平均值与S6磷酸化抑制之间存在显著的负相关。有趣的是，NCI-H1975获得性对奥希替尼耐药的细胞系在未使用奥希替尼的情况下培养，在后续奥希替尼处理后糖酵解没有变化，尽管EGFR有有效抑制作用。在PC9细胞的耐奥希替尼衍生物中也得到了类似的结果，其中奥希替尼处理对乳酸分泌的影响要么没有(PC9-azdr1和PC9-azdr2)，要么很少(PC9-azdr4)。　　

　　通过测量糖酵解的第一步——己糖激酶活性，我们证实奥希替尼对乳酸的影响是由于糖酵解功能的损害。我们看到奥希替尼敏感细胞显示减少己糖激酶活性药物治疗后，而NCI-H1975细胞与获得性耐奥希替尼没有改变己糖激酶活动针对EGFR抑制综合这些数据表明奥希替尼-resistant细胞依赖糖酵解的另一个途径中表皮生长因子受体的缺失。然而，t790m介导的对吉非替尼(PC9-IR4)或万代替尼(pc9-vandetinib)获得耐药的细胞在奥希替尼处理后，乳酸分泌减弱，与它们对该药物的生长敏感性相关。　　

　　此外，奥希替尼处理PC9-VanR细胞后，己糖激酶活性降低。对奥希替尼敏感的PC9细胞进行基因表达分析显示，在奥希替尼后，糖酵解的几个关键调控因子均下调。在一组对奥希替尼敏感的细胞系中，糖酵解基因在mRNA水平上被证实下调，在HCC827和PC9-VanR细胞中尤其明显，而奥希替尼耐药的NCI-H1975细胞中，这组mRNA没有明显下调。此外，24小时奥希替尼治疗PC9，PC9-VanRNCI-H1975细胞导致mRNA的表达显著增加硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)，糖酵解的负调节，这是证实蛋白质含量在34奥希替尼-sensitive细胞系，但不是在耐药细胞。因此，我们得出结论，糖酵解的抑制与奥希替尼的生长抑制相关，而获得性奥希替尼耐药细胞的糖酵解是egfr独立的。　　

　　由于奥希替尼能有效抑制敏感细胞系中的糖酵解，我们推测OxPhos抑制剂可能与奥希替尼协同抑制egfr突变细胞系的生长。我们比较了添加0.1mMphenformin和不添加0.1mMphenformin(近似IC50)时奥希替尼生长响应曲线。Phenformin对PC9和HCC827细胞株的急性奥希替尼敏感性没有影响(SupplementaryFigureS2A，S2B)，而Phenformin对NCI-H1975细胞的奥希替尼敏感性略有增加。相反，NCI-H1975细胞的敏感性等一系列OxPhos抑制剂苯乙双胍，二甲双胍，双胍丁双胍和湾87-2243小分子有效OxPhos抑制性能被添加奥希替尼增强。进一步的证据表明糖酵解和OxPhos的联合抑制可以削弱EGFRm细胞的生长，这一事实提供了证据，寡霉素是一种ATP合酶抑制剂，可阻断OxPhos，使NCI-H1975细胞敏感于2-DG，一种葡萄糖类似物，可阻断糖酵解途径。　　

　　因为奥希替尼未能抑制糖酵解在耐药细胞，我们假设他们会没有增加敏感度OxPhos抑制敏感线相比，确实没有显著增加灵敏度苯乙双胍、二甲双胍。此外，芬formin共处理对耐药细胞奥希替尼的敏感性没有影响。当NCI-H1975、PC9和HCC827细胞单独或联合使用奥希替尼或phenformin处理时，奥希替尼有效地抑制ERK1/2磷酸化，添加phenformin并没有改变这一点。然而，奥希替尼/phenformin治疗对核糖体S6蛋白磷酸化的抑制比单独使用这两种药物更强烈。接下来，我们假设同时抑制糖酵解和OxPhos代谢可能会诱导EGFRm细胞凋亡。　　

　　奥希替尼/苯乙双胍组合显著增加半胱天冬酶激活3/7的一个子集细胞系(NCI-H820、HCC827HCC2935和PC9-VanR)独自奥希替尼，我们观察到一个类似的模式当的一个子集，这些细胞系受到膜联蛋白V染色后复合治疗。我们观察到加入MEK抑制剂selumetinib(AZD6244，arie-142886)后，类似比例的细胞系显示caspase活性增加，正如之前描述的[23]，尽管这两组细胞系并没有完全重叠。　　

　　尽管我们在短期生长试验中发现，在同时使用phenformin治疗的NCI-H1975细胞中，对奥希替尼敏感性增加，但我们希望在一个更能代表临床进展的模型中评估OxPhos抑制剂对获得奥希替尼耐药性的影响。我们采用了一种长期培养系统，细胞被低密度镀在多个孔和长时间培养。在本试验中，所有奥希替尼处理过的NCI-H1975孔在电镀后25天达到耐药，而更敏感的细胞株耐药孔比例更低，耐药中值时间更长。然而，对于所有受测细胞系来说，苯福明以剂量依赖的方式延缓或阻止了奥西莫替尼耐药的发生。　　

　　例如，在PC9细胞中，当30nM的奥希替尼与30μMphenformin联合使用时，只有10%的细胞(3/30)产生耐药性，而使用奥希替尼单药治疗时的耐药性为97%。在奥希替尼浓度为160nM时，60%的井(18/30)达到合流，加入phenformin后达到合流的比例降至17%(5/30)。同样，在NCI-H1975细胞中，100μMphenformin(单药治疗效果可以忽略不计的剂量)阻断了奥希替尼和CO-1686(另一种靶向EGFR的t790m抑制剂)的耐药性)。　　

　　相反，在NCI-H1650细胞中，显示egfr不依赖糖酵解，phenformin与奥希替尼合用时仅具有有限的效果，支持同时抑制糖酵解和OxPhos介导耐药性减弱的假设。此外，将奥希替尼与一组OxPhos抑制剂(二甲双胍、丁双胍、BAY87-2243和寡霉素)联合应用于NCI-H1975细胞，可显著抑制或消除耐药性，而二甲双胍在转化细胞中的作用相对较低。最后，我们确定OxPhos抑制对耐药性的影响与AMPK无关，因为AMPK直接激活剂化合物991和5-氨基咪唑-4-羧基核糖核酸(AICAR)无法改变奥希替尼耐药性的动力学。　　

　　先前的报道表明，相当一部分奥希替尼耐药细胞系对MEK抑制的敏感性显著增强。然而，我们预测在最初的MEK抑制剂敏感性之后将产生耐药性。为了在体外模拟这一现象，将selumetinib敏感的PC9-AZDR1和NCI-H1975-AZDR1细胞按上述方法在长期培养试验中镀皿。selumetinib最初对MEK抑制敏感后，93%和100%的PC9-AZDR1井表现出耐药性(Osi/Sel处理)。相比之下，PC9-AZDR1细胞与奥希替尼、selumetinib和3或10μMphenformin(Osi/Sel/Phen处理)共处理的耐药孔分别仅为27%(8/30)或13%(4/30)。　　

　　类似的结果也出现在独立的奥希替尼耐药、meki敏感细胞系(PC9-AZDR4细胞)。此外，虽然苯甲醛未改变NCI-H1975-AZDR1细胞中显示对Osi/Sel耐药的孔的比例，但显著地将耐药的中位发病时间从18天推迟到28.5天(30μM苯甲醛)或31.5天(100μM苯甲醛)。重要的是，在短期检测中，PC9-AZDR2和NCI-H1975-AZDR4细胞没有表现出增强的MEK抑制剂敏感性，对Osi/Sel组合仅表现出中度敏感性，添加phenformin对耐药性的影响最小。PC9-AZDR1、PC9-AZDR4、NCI-H1975-AZDR1和NCI-H1975-AZDR4细胞经Osi/Sel/Phen联合处理后，与Osi/Sel或Osi/Phen处理相比，S6磷酸化抑制增强。此外，添加phenformin增强了Osi/Sel对PC9-AZDR1细胞的凋亡作用，而对PC9-AZDR2细胞的影响很小。　　

　　NCI-H1975-AZDR1细胞在经过Osi/Sel处理后，与亲代细胞系类似，显示出极少的凋亡，而phenformin不能增强NCI-H1975-AZDR1细胞的凋亡(数据未显示)。我们的模型预测，phenformin抑制PC9-AZDR1、PC9-AZDR4和NCI-H1975-AZDR1细胞Osi/Sel耐药的能力是由于其OxPhos抑制作用。我们看到，虽然奥希替尼PC9-AZDR1乳酸生产没有影响，PC9-AZDR4和NCI-H1975-AZDR1细胞，Osi/选取有效抑制糖酵解在这些细胞(数据(Figures4E4e，S4D)，而这结合抑制EGFR和MEK有限影响不敏感PC9-AZDR2和NCI-H1975-AZDR4细胞。综上所述，这些数据支持了同时抑制糖酵解和OxPhos的观点，这是phenformin和小分子激酶抑制剂协同作用的基础。　　

　　我们假设，在egfr突变的肺癌细胞系中，OxPhos的抑制抑制了奥希替尼耐药的发展。接下来，我们测试了OxPhos活性增强的细胞是否显示奥希替尼耐药性增强。OxPhos可以通过改变细胞中的主要燃料来源，从葡萄糖变为乳糖或半乳糖来上调，这迫使细胞通过线粒体呼吸产生ATP。正如预期的那样，半乳糖被镀的NCI-H1975细胞对苯双胍的敏感性增强，但有趣的是，对奥西莫替尼的敏感性明显降低。　　

　　同样，HCC827细胞在半乳糖培养基中培养时，显示出明显的奥希替尼耐药性，而PC9细胞在含乳酸培养基中显示出降低的奥希替尼敏感性。OxPhos也可以通过丝氨酸剥夺而增强，因为细胞将糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸转移到丝氨酸的新合成途径。在丝氨酸/甘氨酸缺失条件下(SFM)，4个细胞株中的3个表现出明显的奥希替尼耐药。　　

　　为了进一步探索这一现象，我们在SFM中延长培养(>21天)，生成PC9细胞的“剥夺丝氨酸”(SD)衍生物。这些细胞显示糖酵解减少，当丝氨酸添加回培养物时，糖酵解持续减少。此外，在完全RPMI培养基中生长时，它们对苯formin的敏感性增强。在短期生长试验中，PC9-SD细胞中未观察到增强的奥希替尼耐药性，但它们显示出奥希替尼诱导的凋亡显著减少。重要的是，当这些细胞在长期耐药试验中被电镀时，PC9-SD细胞显示出明显更早的耐药发生。　　

　　有趣的是，与亲代细胞相比，奥希替尼（泰瑞沙）处理后PC9-SD细胞保持更高程度的S6磷酸化。因此，当egfr突变细胞通过OxPhos而不是糖酵解获得ATP时，它们表现出对奥希替尼敏感性降低，而对OxPhos抑制剂敏感性增加。详情请扫码咨询：