为了鉴定能减弱奥希替尼在EGFR突变肺癌中的作用的激酶，我们使用PC-9/BRc1(EGFR外显子19缺失/T790M)细胞进行了全基因组siRNA筛选，发现31个siRNA对奥希替尼敏感。在排名前10位的hits中，我们确定MAPK1、BRAF和PDPK1为奥希替尼治疗的衰减因子。此外，PIK3C2A和PIK3CB均编码磷酸肌醇3-激酶(PI3K)亚基，进入前30位。
PI3K和PDK1是AKT通路的组成部分，而BRAF和ERK2是MAPK通路的组成部分。这些数据表明，即使在EGFR持续抑制的情况下，EGFR下游的AKT和MAPK信号通路仍然是活跃的，并可能独立地促进增殖/存活。基于这些数据，我们检测了奥希替尼处理后AKT和MAPK信号通路的变化，重点关注关键信号激酶的磷酸化。
EGFR的磷酸化被奥希替尼完全抑制，而AKT通路成分包括PDK1、AKT和S6的磷酸化仅部分受阻。BRAF、MEK和ERK磷酸化-MAPK通路的组成部分-也持续存在或在奥希替尼治疗后重新激活。在其他EGFR突变的NSCLC细胞系中也观察到类似的结果，以及其他EGFRTKIs，包括厄洛替尼和罗西替尼。这些观察结果表明，在EGFR持续抑制的情况下，AKT和MAPK通路的下游信号仍然部分活跃。
接下来，我们确定联合靶向EGFR和下游通路是否会导致更完全的信号传导抑制和对生长抑制的更大作用。与单独使用奥希替尼相比，联合使用奥希替尼和pan-PI3K抑制剂BKM120或PDK1抑制剂GSK2334470共同处理PC-9/BRc1细胞可以抑制AKT磷酸化(对ERK磷酸化没有进一步影响)。与单独使用奥希替尼相比，奥希替尼+BKM120或GSK2334470也具有更强的增殖抑制作用。
我们通过与奥希替尼和一种pan-RAF抑制剂TAK632或变构MEK抑制剂selumetinib共处理PC-9/BRc1细胞，检测了MAPK通路的垂直抑制。TAK632和selumetinib在任何时间点都不能完全抑制ERK磷酸化。然而，两者联合使用奥希替尼可以完全抑制ERK磷酸化，与单独使用任何药物相比，可以更有效地抑制细胞增殖。这些数据表明，在egfr靶向治疗中加入AKT或MAPK通路抑制剂是egfr突变型肺癌的合理联合治疗策略。
SFKs在EGFR抑制存在的情况下维持MAPK通路信号
接下来，我们探索了奥希替尼存在下AKT和MAPK信号通路持续信号传导的潜在机制。为了排除药物水平不足的可能性，我们检查了大剂量奥西莫替尼的影响。然而，增加奥希替尼浓度并没有进一步抑制EGFR、AKT或ERK磷酸化，也没有消除96小时后的通路再激活。此外，PC-9/BRc1细胞的活力在100nM奥希替尼时达到最大损失。这些数据表明AKT和MAPK信号的持续传递并不是由于EGFR抑制不足。
我们试图更好地描述暴露于奥希替尼96小时后仍能存活的细胞群。为了评估奥希替尼是否对剩余人群的细胞生长抑制作用较弱，我们使用PC-9/BRc1细胞，用100nM奥希替尼或vehicle预处理96小时，生成浓度-反应曲线。我们发现DMSO预处理细胞与奥希替尼预处理细胞的EC50无差异(3.46vs.3.44nM，p=0.96)。
同样，对奥希替尼暴露96小时后的EGFR外显子19、20和21进行测序，在五种受测细胞系中均未发现EGFR激酶结构域内的任何新突变(数据未显示)。综上所述，这些数据表明，奥希替尼治疗并不能快速选择具有初级奥希替尼耐药性的克隆。另外，为了探索潜在的“旁路”信号通路，我们使用受体酪氨酸激酶阵列分析了用奥希替尼处理的PC-9/BRc1细胞的裂解物，发现药物处理后，人表皮生长因子受体3(HER3)的磷酸化水平增加。然而，HER3敲低对AKT或ERK磷酸化没有影响，表明在这些细胞模型中，在奥希替尼处理后，HER3并没有作为一个“旁路”信号。
接下来，我们关注了Src家族激酶(SFKs)的潜在作用，因为SFKs是AKT和MAPK信号通路的上游调控因子。有趣的是，免疫印迹分析显示，奥希替尼处理后SFKs磷酸化水平升高。治疗PP2，选择性SFK抑制剂，或达沙替尼，一个目标SFKsmulti-kinase抑制剂，减毒SFK激活的奥希替尼。值得注意的是，PP2或达沙替尼治疗也导致更深刻的抑制ERK的磷酸化而独自奥希替尼（AZD9291），这表明活动SFKsMAPK通路的持续的表皮生长因子受体信号的缺失。
此外，与奥希替尼单药治疗相比，PP2或达沙替尼联合治疗PC-9/BRc1细胞增强了生长抑制效果。另外两种具有抗sfk活性的临床相关TKIs联合使用奥希替尼与bosutinib或沙拉卡替尼，与单独使用奥希替尼相比，也可改善细胞生长抑制。详情请扫码咨询：
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