奥希替尼AZD9291耐药是否可以通过外泌体转移

　　采用超离心法分离非小细胞肺癌患者和抗奥希替尼患者血浆中的外泌体。为了确定分离的细胞外颗粒是否为外泌体，我们采用TEM、NTA和westernblot对其进行了表征。透射电镜得到的典型形态显示，颗粒为圆形或椭圆形的囊泡，具有双层膜。通过NTA测定纯化后的颗粒的尺寸分布，奥希替尼敏感的外泌体的峰值直径为115nm，而奥希替尼耐药的外泌体的峰值直径为121nm。westernblot检测外泌体特异性标志物CD9、CD63、CD81的蛋白表达。综上所述，这些结果表明血浆中分离出的细胞外颗粒是外泌体。　

　　对奥希替尼耐药的血浆来源外泌体和对奥希替尼敏感的血浆来源外泌体的lncRNA谱进行表征　

　　LncRNA可能通过外泌体转移导致耐药。因此，我们进一步研究了可能在奥希替尼耐药过程中发挥重要作用的lncrna。对对奥希替尼耐药的外泌体和对奥希替尼敏感的外泌体进行LncRNA测序。根据|log2FC|>1和FDR<0.05的标准，共鉴定123个差异lncRNA，其中45个上调lncRNA,78个下调lncRNA。两个上调的lncrnaMSTRG.292666.16(log2FC=6.05318,P=0.009671)和MSTRG.292667.12(log2FC=3.853559,P=0.034019)在血浆和外泌体中得到了进一步的qRT-PCR验证。　

　　MSTRG.292666.16和MSTRG.292667.12在抗奥希替尼血浆中的相对表达水平明显高于对奥希替尼敏感的血浆(P<0.05)。奥希替尼耐药的外泌体和奥希替尼敏感的外泌体进行了进一步的验证。结果显示，MSTRG.292666.16在抗卵巢癌外泌体中的相对表达水平明显高于对卵巢癌敏感的外泌体(P<0.05)，这与lncRNA测序结果一致。而lncRNAMSTRG.292667.12两组间差异无统计学意义(P>0.05)。因此，我们选择lncRNAMSTRG.292666.16进行进一步分析。　

　　H1975R细胞来源的外泌体可被H1975S细胞摄取　　

　　既往研究表明，外泌体可能通过转移功能性遗传物质参与耐药过程。为了确认对奥希替尼的耐药是否可以通过外泌体转移，在连续暴露于逐步增加浓度的奥希替尼6个月后，建立了对奥希替尼耐药的H1975细胞系H1975R。CCK-8实验表明，即使使用640nM奥希替尼处理，H1975R细胞的细胞存活率也没有显著变化。qRT-PCR结果显示，lncRNAMSTRG.292666.16和MSTRG.292667.12在H1975R细胞中表达明显高于H1975S细胞(P<0.001)。然后从条件培养液中分离出H1975R和H1975S的外泌体。　　

　　透射电镜显示，这些外泌体是典型的杯状纳米颗粒。NTA显示h1975-外泌体的峰值直径为119nm，而h1975r-外泌体的峰值直径为121nm。Westernblot进一步证实了外泌体标记CD9、CD63和CD81阳性表达，Calnexin阴性表达。这些结果表明，外泌体分离成功。此外，qRT-PCR提示lncRNAMSTRG.292666.16在h1975r-外泌体中的表达明显高于h1975s-外泌体(P<0.001)。　

　　为了研究外泌体是否能被受体细胞吸收，我们将H1975S细胞与PKH67标记的H1975R外泌体共培养。共焦显微镜检查显示，h1975细胞在细胞核周围和细胞质中可见PKH67绿色荧光信号。这一结果证实了H1975S细胞摄取了pkh67标记的H1975R外泌体。　　

　　奥希替尼耐药外泌体逆转奥希替尼诱导的H1975细胞基因表达变化　　

　　检测奥希替尼耐药外泌体对miR-21、miR-125b、TGFTGFinhibitor、ARF6、c-Kit等几个基因表达的影响。100nM奥希替尼处理24小时后，miR-21、miR-125b、TGFTGFTGFTGFTGF和ARF6的相对表达水平显著上调，但与10个对奥希替尼耐药的外泌体共孵育可逆转单独使用奥希替尼对基因表达变化的影响(P<0.05)。在奥希替尼处理的H1975细胞中，c-Kit的相对表达显著下调，而与抗奥希替尼的外泌体共孵育时，c-Kit的表达显著上调(P<0.05)。这些结果表明，抗奥希替尼的外泌体可以调控奥希替尼诱导的基因表达。　　

　　奥希替尼耐药外泌体诱导H1975细胞对奥希替尼的耐药　　

　　进一步调查的功能角色奥希替尼-resistant液在肺癌细胞的抗奥希替尼,H1975细胞治疗100海里奥希替尼24h,然后用不同浓度的孵化奥希替尼-resistant液48h。首先,H1975细胞治疗与不同浓度的奥希替尼确定奥希替尼的治疗浓度。H1975细胞存活率显著下降，呈奥希替尼依赖性。40nM及以上剂量组H1975细胞存活率明显低于对照组(P=0.0006)。计算其IC50，结果显示奥希替尼的IC50为118.7nM。因此，我们进一步使用118.7nM奥希替尼进行实验。　　

　　为了研究奥希替尼耐药是否可以通过外泌体转移，我们将H1975细胞与118.7nM的奥希替尼和不同浓度的奥希替尼耐药外泌体共培养。CCK8实验显示，与对奥希替尼耐药的外泌体共培养可以显著降低H1975细胞对奥希替尼的敏感性，并以剂量依赖的方式提高其相对存活率。特别是，与未孵育的H1975细胞相比，孵育10个和20个对奥希替尼(AZD9291)耐药的外泌体的细胞存活率显著提高(P<0.0001)。　　

　　我们进一步研究了显著上调的lncRNA是否也被外泌体转移到H1975细胞中。用qRT-PCR检测MSTRG.292666.16在H1975细胞和耐奥希替尼外泌体孵育的H1975细胞中的相对表达。结果显示，MSTRG.292666.16在H1975细胞中，与未处理的H1975细胞相比，抗奥希替尼外泌体的相对表达显著上调(P<0.05)。　　

　　LncRNAMSTRG.2992666.16可能与奥希替尼耐药有关　　

　　为了进一步研究MSTRG.292666.16在奥希替尼耐药中的意义，我们将siRNA-MSTRG.292666.16转入H1975细胞。MSTRG.292666.16在H1975细胞中的相对表达明显降低(P<0.01)。CCK-8实验表明，敲除MSTRG.292666.16对H1975S细胞的存活率无明显影响。与siRNA-NC组相比，siRNA-MSTRG.292666.16处理H1975R细胞的细胞存活率明显下降(P<0.05)。提示lncRNAMSTRG.292666.16可能与奥希替尼耐药有关。详情请扫码咨询：