细胞裂解前索拉非尼/仑伐替尼处理HCC细胞

　　洗涤细胞并用含有蛋白酶抑制剂混合物和Halt磷酸酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液裂解。为了检查体外对FGF信号通路的影响，在细胞裂解之前，先用乐伐替尼（仑伐替尼），索拉非尼或媒介物（DMSO）处理HCC细胞1小时。将细胞在含有0.5％BSA的培养基中饥饿过夜。与每种药物一起孵育1小时；用100mg/mLFGF19处理5分钟；然后洗净并溶解。为了检查体内对FGF信号通路的抑制作用，携带异种移植肿瘤的小鼠接受了乐伐替尼，索拉非尼或相应的媒介物的单次治疗； 2小时后收集肿瘤；然后将样品均质化并裂解。

　　离心清除细胞和肿瘤裂解液，在1x Laemmli样品缓冲液中变性，通过SDS-PAGE分离，并转移至PVDF膜上。将膜与针对Erk1/2和p‐Erk1/2的抗体孵育推荐浓度的KLB和FRS2，β‐actin和FGF19，对条带进行可视化。将人类HCC细胞以1×103细胞/孔的量接种在96孔板上，并在37°C的5％CO2中培养。第二天，用乐伐替尼，索拉非尼或媒介物的1：2系列稀释液处理细胞，并培养6天。测量细胞活力，并使用GraphPad Prism测定IC50值。每个实验包含一式三份的样品，并进行了三个独立的实验。

　　在最后一次给药后的第二天收集异种移植肿瘤。肿瘤片段用10％福尔马林固定并包埋在石蜡中，肿瘤片段除外，将其冷冻在OCT化合物中，组织切片用冷丙酮固定。如先前所述，用抗CD31抗体染色内皮细胞并进行微血管密度测量。简要地，用抗CD31抗体对组织切片进行染色，并使用 ScanScope扫描载玻片XT系统。手动选择了密度最高的CD31染色微血管的五个感兴趣区域（ROI，每个500×500μm），并测量了每个ROI中的微血管数量。

　　Ki-67阳性细胞用抗Ki-67抗体染色，并使用Envision+单试剂进行检测。 Ki-67阳性核的百分比使用HALO软件（Indica Labs，Corrales，NM）进行定量。FGF信号通路的激活与HCC的进展有关，并且HCC子集的增殖依赖于FGF信号通路。由于乐伐替尼抑制FGFR，我们首先研究了乐伐替尼的抗增殖活性体外有九种HCC细胞系。 乐伐替尼对HCC细胞系Hep3B2.1-7，HuH-7和JHH-7表现出选择性和有效的抗增殖活性，IC50值分别为0.23、0.42和0.64μmol/ L。免疫印迹分析表明，FGF19，FGFR4和β-Klotho在这三种细胞系中均高表达，表明FGF19–FGFR4轴被激活，与先前的报道一致。

　　乐伐替尼还显示出中度抑制作用SNU-398，Li-7和HuH-1细胞增殖的IC50值分别为1.56和2.59μmol/ L。尽管未表达FGF19蛋白，但在这些细胞中检测到了一些FGFR家族成员。由于这些细胞系对pan-FGFR抑制剂中等敏感，因此乐伐替尼可能会通过靶向激活的FGF信号通路来抑制细胞的增殖。 乐伐替尼对SK‐HEP‐1，SNU‐449或PLC/PRF/5细胞没有显示出明显的抗增殖活性，它们也对pan-FGFR抑制剂不敏感。

　　作为参考，我们还检查了索拉非尼在9种HCC细胞系中的抗增殖活性。索拉非尼未对具有高表达的HCC细胞系表现出选择性的抗增殖活性。这些结果表明，乐伐替尼通过激活的FGF信号通路选择性抑制HCC细胞的增殖。乐伐替尼以V型结合模式28与受体酪氨酸激酶VEGFR2结合；这可能有助于其高亲和力和对少量受体酪氨酸激酶的选择性。 乐伐替尼复合物的共晶体分析表明乐伐替尼也结合了。现在乐伐替尼的价格是多少？在哪里购买？更多详情可咨询下方微信。