尼达尼布抑制控制肺成纤维细胞的生长和活化

　　尼达尼布抑制控制肺成纤维细胞的生长和活化

　　模仿增长或pro-fibrotic僵硬体外微环境，我们在collagen-coated刺激成纤维细胞培养的组织培养塑料与10%的边后卫(富含纤维母细胞分裂素PDGF或2.5ng毫升−1的强有力的纤维母细胞活化剂TGF-β1。正如预期的那样，这样的刺激可以诱导成纤维细胞增殖(10%胎牛血清)或活化(TGF-inhibitor1)的显著增加。为了确定尼达尼布的合适剂量范围，我们首先检查了该药物对对照成纤维细胞的生存能力和生长的影响。尼达尼布不影响在10%胎牛血清中培养5天至5°m的成纤维细胞的生存能力。相比之下，尼达尼布以剂量依赖的方式阻止了10%胎牛在有丝分裂刺激时成纤维细胞数量的增加，而DMSO载体没有。为了证实尼达尼布的抗增殖作用，我们通过流式细胞仪分析了循环成纤维细胞的百分比。与我们的成纤维细胞数量密度数据定性一致的是，尼达尼布在10%胎牛血清刺激5天后下调了循环成纤维细胞的上升。仅在2次注射尼达尼布治疗12小时后，循环成纤维细胞的显著下降也被观察到，这表明该药物诱导成纤维细胞早期生长阻滞。

　　我们下一个检查的antifibrotic影响尼达尼布通过评估小组的表达pro-fibrotic标记包括alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma)，纤维胶原蛋白(COL1A1和COL3A1)和prolyl-4-hydroxylaseα亚基2(P4HA2)——一个重要的酶胶原生物合成调节的TGF-β在对照组中，用TGF-inhibitor1或DMSO刺激成纤维细胞3天。尼达尼布以剂量依赖的方式下调TGF-TGF1同时刺激对COL1A1和蝎尾细胞-sma的显著诱导，而DMSO载体没有下调。同样尼达尼布剂量依赖性降低COL3A1和P4HA2表达式控制成纤维细胞。非常尼达尼布甚至减少COL1A1和α在控制成纤维细胞预先激活smaTGF-β13天我和J。这些结果强调这种药物的健壮的抑制性影响纤维胶原蛋白和collagen-related基因的表达。总之，我们的结果扩展了之前对尼达尼布在正常和ipf来源的肺成纤维细胞中的抗增殖和抗纤维化作用的观察的研究表明，这种抑制功能的特征是IC50(约0.8-1)的浓度，这与使用该药物的体内研究中报道的尼达尼布的最大浓度相当。

　　SCC-TAFs对尼达尼布的抗纤维化反应低于ADC-TAFs，但具有类似的抗增殖作用

　　在ADC和SCC中，与成对对照成纤维细胞相比，患者源性肺TAFs过表达激活标记物。然而，我们最近报道了两种亚型的TAFs中明显的表型改变，这表明它们可能对尼达尼布表现出亚型特异性的反应。为了检验这种可能性，我们首先在增加尼达尼布或DMSO载体剂量的情况下，用10%胎牛血清刺激ADC-TAFs和SCC-TAFs。与对照组成纤维细胞一样，尼达尼布不影响TAFs的存活能力，最高可达5倍。与对照成纤维细胞进一步一致的是，在10%胎牛血清刺激下，尼达尼布剂量依赖性地阻止了成纤维细胞数量和循环成纤维细胞百分比的增加，而DMSO载体没有。这种对细胞周期的显著影响可以在处理后12小时观察到，表明尼达尼布也会导致TAFs的早期生长停滞。这些实验表明，尼达尼布在TAFs中的抗增殖作用在ADC和鳞状细胞癌中在数量上是相似的，其IC50值也与对照成纤维细胞的IC50值相近。

　　与生长抑制，即使ADC-TAFs和SCC-TAFs成为激活在TGF-β1刺激，尼达尼布抑制TAF激活响应TGF-β1一直在ADC-TAFs比SCC-TAFs所有pro-fibrotic标记检查(即纤维胶原蛋白a和B，αsma和P4HA2与统计学意义在不同尼达尼布浓度，而DMSO载体处理后未见表达变化。这样微分antifibrotic反应taf引起COL1A1IC50值和COL3A1SCC-TAFs的2.2-1.4倍高于ADC-TAFs。因为IC50值对纤维ADC-TAFs和控制成纤维细胞胶原蛋白非常相似，我们的数据显示，首次SCC-TAFs展览尼达尼布antifibrotic反应，而ADC-TAFs展览正常antifibrotic应对这种药物。

　　肺TAFs在体内处于静止和激活状态，这表明尼达尼布在TAFs中的亚型特异性抗纤维化功能可能与病理相关

　　体外观察到的SCC-TAFs和ADC-TAFs对尼达尼布的显著抗增殖和抗纤维化反应提出了这些作用在体内哪些可能更相关的问题。为了阐明这一问题，我们分析了获得原发性TAFs的同一队列患者的组织学切片中TAFs的增殖和激活状态。我们的组织学分析显示，在ADC和鳞状细胞癌中，增殖标志物Ki-67大多为阴性，而相当一部分癌细胞为Ki-67阳性。相反，在ADC和SCC中，几乎所有的TAFs都对激活标记物-SMA呈阳性，这与我们组之前的观察结果一致(Puigetal，2015)。由于TAFs在组织学切片中大部分是静止和活化的，因此可以想象尼达尼布对ADC-TAFs和SCC-TAFs的不同抗纤维化作用可能比其抗增殖功能更具治疗相关性。

　　尼达尼布消除了ADC中激活的TAFs在条件培养基诱导下的癌细胞生长和侵袭，而非鳞状细胞癌

　　为了验证后一种解释，我们评估了尼达尼布对激活的TAFs两种重要的促肿瘤作用的抑制作用:刺激癌细胞生长和侵袭。为此，我们刺激ADC-TAFs或SCC-TAFsTGF-β1在3天2μm尼达尼布的存在与否，这可比的IC50SCC-TAFs(表1)，清洗介质，取而代之的是尼达尼布-free和无血清纤维母细胞中。在这些条件下，无论尼达尼布是否存在，成纤维细胞的数量都没有明显变化。CM用于刺激ADC和SCC细胞系的生长和侵袭，这些细胞系是根据EGFR和KRAS野生型状态选择的，以模拟可能接受尼达尼布治疗的患者的关键遗传特征。

　　与预期的一样，在ADC和SCC细胞系中，活化的TAFs的CM相对于无血清的控制介质诱导了强劲的(约1.5-2倍)生长增强。值得注意的是，仅在ADC细胞系中，使用CM，从激活的TAFs中使用2甲基尼达尼布处理后，癌细胞的这种生长增强降低了约30-40%，而在SCC细胞中几乎没有改变。在分析侵袭数据时，尼达尼布对ADC细胞的选择性治疗效果更为显著。因此，在ADC和SCC细胞系中，相比于无血清控制介质，经matrigel包覆Transwell插入激活的TAFs的CM显著增加(约1.5-2.5倍)。相比之下，在ADC细胞系中，当使用来自激活TAFs的CM，用2个甲基尼达尼布处理时，细胞浸润的增加减少了约60-70%，而在SCC中未观察到浸润的减少。这些体外观察结果与临床试验中观察到的尼达尼布在ADC患者中的选择性抗癌作用定性一致。此外，这些结果首次表明，尼达尼布在体外可对ADC而非鳞状细胞癌中活化的TAFs分泌的可溶性因子的生长和侵袭优势产生强大的抑制作用。

　　最后，为了评估肿瘤细胞自身对尼达尼布对癌-taf串扰治疗效果差异的潜在贡献，我们用ADC-TAFs的CM刺激SCC细胞，反之亦然。可以设想四种不同的情形。应该观察到微分尼达尼布反应很大程度上是由于taf，然后厘米ADC-TAFs对待尼达尼布鳞状细胞癌的细胞应该引起积极的治疗反应在。相反，应该观察到的反应很大程度上是由于癌的细胞，那么结果应该反向(即用尼达尼布处理的ADC-tafs在鳞状细胞上的CM应诱导阴性治疗反应，而在ADC细胞上的鳞状细胞-tafs的CM应诱导阳性治疗反应)。其中ADC和SCC样本分别用蓝色和红色标记，便于实验解释。用尼达尼布处理的ADC-TAFs在SCC细胞上的CM在生长和侵袭方面都引起了阴性的治疗反应。相比之下，用尼达尼布处理的鳞状细胞癌-tafs在ADC细胞上的CM在生长方面呈阴性反应，但在侵袭方面呈阳性反应。这些结果支持在TAFs和癌细胞之间存在分工，其中SCC-TAFs和癌细胞本身(ADC和SCC)对尼达尼布观察到的差异治疗反应起作用。

　　高尼达尼布剂量诱导暗示自噬空泡的结构

　　在我们的实验过程中，我们通过相位对比显微镜观察到，在所有实验条件下(10%胎牛血清，TGF-TGF1)，在检测的最高尼达尼布浓度(2-5×m)下，正常成纤维细胞和TAFs均一致形成大的空泡结构。最近在其他地方用尼达尼布治疗的肺成纤维细胞中也报道了类似的空泡结构，并被解释为自噬诱导的指标(Rangarajanetal，2016)。自噬是一个高度保守的生物过程，允许降解和循环的细胞成分。这种降解过程与细胞对不同类型应激的反应有关。因此，可以想象，高尼达尼布浓度可能在对照成纤维细胞和TAFs中诱发自噬应激反应。尼达尼布一盒多少钱？一盒可以吃多久？详情请扫码咨询：