劳拉替尼(lorlatinib)耐药性模拟

　　晚期ALK阳性肺癌治疗的基石是采用越来越有效的选择性ALK抑制剂进行序贯治疗。第三代ALK抑制剂劳拉替尼（lorlatinib）已在先前ALK抑制剂治疗失败的患者中证明了其临床活性。为了确定赋予洛拉替尼耐药性的ALK突变谱，我们对表达EML4-ALK的Ba / F3细胞进行了加速诱变筛选。在可比的条件下，ENU诱变产生了许多具有单个ALK突变的耐克唑替尼的克隆，但没有耐劳拉替尼的克隆。在包含单个ALK抗性突变的EML4-ALK的类似筛选中，出现了许多含化合物ALK的耐lorlatinib的克隆突变。为了确定这些突变的临床相关性，我们分析了对劳拉替尼耐药患者的重复活检。20个样本中有7个（占35％）具有复合ALK突变，其中两个在ENU筛选中鉴定出。在三例病例中，整个外显子组测序证实了在顺序治疗期间ALK突变的逐步积累。这些结果表明，顺序的ALK抑制剂可以促进化合物ALK突变的出现，对其的鉴定对于告知药物设计和制定有效的治疗策略至关重要。

　　平行方法中，我们用浓度递增的劳拉替尼治疗了敏感的H3122细胞超过4个月，直到出现耐药为止。最终衍生出三个独立的耐药细胞系（H3122 LR-A，LR-B和LR-C），并维持在1μM氯雷替尼中。在细胞生存力测定中，所有这三种细胞系均对劳拉替尼具有抗药性，并且在ALK酪氨酸激酶结构域中没有一个具有继发性突变。值得注意的是，在对克唑替尼耐药性的类似研究中，我们先前在体外对克唑替尼产生耐药性的H3122细胞中发现了ALKL1196M Gatekeeper突变。

　　为了模拟体内对lorlatinib的耐药性，我们从敏感的EML4-ALK v1细胞系MGH006生成了皮下肿瘤。如先前报道，用洛拉替尼经口管饲法治疗荷瘤小鼠，导致肿瘤消退超过50天。继续接受氯雷替尼治疗后，六个肿瘤中的三个显示出与抗药性出现一致的再生长。从抗性肿瘤中衍生出三种细胞系（MGH006 LR-B1，G3和J2）。与体外生成的模型一样，所有三种细胞系在细胞培养中均对lorlatinib产生抗性，并且都没有ALK抗药性突变。综上所述，这些结果支持以下观点：没有单个ALK突变会赋予对lorlatinib的抗药性。

　　劳拉替尼耐药性ALK突变体外功能验证：

　　我们独立地产生了表达3所识别的化合物的突变的Ba / F3细胞系-ALKG1202R / L1196M，ALKG1202R / L1198F，和ALKL1196M / L1198F。用克唑替尼，塞立替尼，阿来替尼，布里亚替尼或洛拉替尼处理细胞，并在48小时后测定细胞活力。与ALKG1202R或L1196M单突变体相比，化合物ALKG1202R / L1196M突变体对劳拉替尼具有高水平的耐药性。ALKG1202R / L1196M双突变也是对所有测试的第一代和第二代ALK抑制剂耐药。相反，含ALKL1198F的化合物突变体对劳拉替尼和第二代ALK抑制剂具有抗性，但对克唑替尼表现出敏感性。对于所有这些研究，使用EML4-ALK的变体1或变体3获得了相似的结果。

　　接下来，我们通过检查用劳拉替尼治疗的不同Ba / F3模型中的ALK磷酸化，评估了化合物ALK突变体的生化抑制作用。与细胞活力分析的结果一致，lorlatinib处理抑制了非突变ALK和单个ALK突变体的ALK磷酸化，但未能抑制ALK G1202R / L1196M，ALK G1202R / L1198F和ALK L1196M / L1198F复合突变体的ALK磷酸化。因此，在存在劳拉替尼的情况下，通过ENU诱变筛选鉴定出的化合物ALK突变体可维持ALK激活。

　　为了验证Ba / F3细胞的发现，我们将敏感的EML4-ALK v1肺癌细胞H3122工程化为过表达EML4-ALK G1202R / L1196M。与Ba / F3数据一致，与过表达ALK G1202R的H3122细胞相比，过表达ALK G1202R / L1196M的H3122细胞对劳拉替尼具有高度抗性（分别为IC502,253 nM对46 nM）。另外，劳拉替尼治疗不能抑制化合物ALK突变体的ALK磷酸化，但能够抑制非突变和单个ALK G1202R突变体H3122细胞的ALK磷酸化。微信扫描下方二维码了解更多：