帕博西尼/哌柏西利治疗乳腺癌的公开临床试验

　　低临床相关浓度的帕博西尼以剂量依赖的方式增加GFP+自噬体的水平，数小时后RFP+自噬溶酶体水平升高。虽然自噬小体水平升高，但未观察到mTOR(mTORC1S2448磷酸化)活性的显著变化。由于帕博西尼似乎以一种独立于mTOR的方式刺激自噬，我们确定了mTORC1活性的抑制剂temsirolimus是否能增强帕博西尼的致死率。在包括乳腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞类型中，temsirolimus和帕博西尼相互作用增强了对乳腺、结肠、NSCLC和黑色素瘤细胞的杀伤，但对胃癌细胞没有杀伤作用。　　

　　本小组最近的研究表明，不可逆ERBB1/2/4抑制剂neratinib可以增加自噬体和自噬溶酶体的水平，导致RTKs和RAS蛋白的下调，并导致肿瘤细胞的杀伤。因此，下一步我们将确定自噬体诱导药物帕博西尼是否与自噬体诱导药物neratinib相互作用杀灭肿瘤细胞。在乳腺、结肠、非小细胞肺癌、肉瘤、胰腺癌和肾癌细胞中，neratinib和帕博西尼以一种大于加性的方式相互作用，导致肿瘤细胞在24小时后死亡。之前我们已经证明了neratinib可以杀死耐药的H1975NSCLC克隆。3[neratinib+帕博西尼]组合在24h后杀死野生型亲本H1975克隆和抗阿法替尼亲本H1975克隆，抗阿法替尼亲本克隆的杀死量明显大于野生型亲本克隆。　　

　　基于我们的杀伤数据，我们随后以一种不可知的方式进行研究，以检查由[neratinib+帕博西尼]引起的细胞信号转导过程的任何变化。在BT474(乳腺)和Spiky(卵巢)癌细胞中，[纳拉替尼+帕博西尼]联合用药增加了eIF2的subers51、ATM的S1981、AMPK的subert172、TSC2的T1496、Raptor的S792、ULK-1的S317和ATG13的S318的磷酸化。联合用药降低了mTORS2448和S2481、ULK-1S757、ERK1/2、AKTT308和STAT3Y705的磷酸化水平。此前对neratinib的研究表明，它可以激活ATM-AMPK-ULK-1-ATG13通路，导致mTOR失活，导致自噬小体水平升高。3值得注意的是，不管LKB-1的表达/功能如何，帕博西尼都增强了AMPK的inhibitorT172的磷酸化。在所有被测的细胞系中，neratinib和帕博西尼以一种比加性更大的方式相互作用，增加了自噬体水平，并随之增加了自噬体水平。　　

　　接下来，我们试图将细胞信号和生物学的变化与[neratinib+帕博西尼]杀死肿瘤细胞的分子机制联系起来。ATM、AMPK、Beclin1或ATG5的敲除显著降低了联合用药的致死率。Beclin1或ATG5的缺失也降低了帕博西尼作为单一药物的致死率。联合用药可增加Beclin1和ATG5的表达，降低BCL-XL和mcl1的表达。在乳腺癌细胞中，过表达BCL-XL或敲除BAX、BAK或AIF对细胞具有持续保护作用。在两株细胞系中，一株乳腺细胞和一株卵巢细胞中，caspase8/10抑制剂c-FLIP-s的过表达部分降低了杀伤活性，在同一株乳腺细胞系中，显性阴性caspase9的过表达也部分降低了杀伤活性。在卵巢癌细胞中，过表达BCL-XL和显性阴性caspase9均无保护作用。这些数据共同表明，自噬在介导[neratinib+帕博西尼]的肿瘤细胞杀伤中发挥关键作用，而且相比caspase9，线粒体下游的细胞执行更依赖于AIF。

　　我们确定联合用药降低了ERK1/2、AKT和STAT3的活性。过表达活化的AKT或过表达活化的MEK1对BT474乳腺肿瘤细胞的保护作用(neratinib+帕博西尼)大于表达活化的STAT3。活化AKT的表达抑制了mTOR的失活和ULK-1的活化，这也可以通过ATG13磷酸化水平的降低来判断。活化的AKT和活化的MEK1均抑制了[neratinib+帕博西尼]增强BIM、Beclin1和ATG5的表达。然而，激活的MEK1和少量激活的AKT，并没有改变药物诱导的eIF2subs51磷酸化水平。也就是说，观察到的内质网应激信号通路的升高在杀死肿瘤细胞方面的重要性可能低于AKT、mTOR和ERK1/2MAP激酶通路的失活。在刺状卵巢癌细胞中也得到了类似的数据。　　

　　目前有一项联合奈拉替尼和帕博西尼治疗乳腺癌的公开临床试验。我们将与Puma生物技术合作，将纳拉替尼和HDAC抑制剂丙戊酸钠联合应用于所有符合条件的实体肿瘤患者，开展一期临床试验。在之前的几篇文章中，我们已经表明HDAC抑制剂丙戊酸钠(Depakote®)和PDE5抑制剂西地那非(伟哥®)都可以增强由其他药剂引起的自噬体和自噬溶酶体的形成，从而导致肿瘤细胞杀伤水平的升高。10-12因此，我们下一步确定丙戊酸盐或西地那非是否能增强“自噬”，从而提高[neratinib+帕博西尼]的致死率。　　

　　用neratinib或帕博西尼治疗多个乳腺和卵巢肿瘤细胞系可增加肿瘤细胞内自噬小体的数量。这两种药物联合使用可显著提高自噬小体水平。丙戊酸钠以高于添加剂的方式进一步增强了自溶酶体的形成。自噬通量似乎在所有处理条件下都出现，GFP+自噬体的升高在4小时后降低了8小时，RFP+自噬溶酶体的数量在4小时时可以忽略，但在8小时后显著增强。接下来，我们确定丙戊酸钠和西地那非对[neratinib+帕博西尼]致死性的影响，注意，在孵育12小时后。Neratinib和帕博西尼以大于加性的方式相互作用杀死乳腺和卵巢肿瘤细胞。从自噬生物标志物中观察到，丙戊酸钠以大于加性的方式进一步增强了[Neratinib+帕博西尼]对肿瘤细胞的杀伤作用;西地那非效果较差。随着[奈拉替尼+帕博西尼]和[奈拉替尼+丙戊酸盐]联合应用的临床研究正在进行，这些数据将共同为未来可能进行的奈拉替尼和丙戊酸钠联合应用三种药物的安全RP2D试验提供证据。　　

　　接下来，我们进行了研究，以确定丙戊酸盐如何改变细胞信号转导过程，增强自噬和细胞杀伤反应[neratinib+帕博西尼]。[neratinib+帕博西尼+丙戊酸]处理细胞可使ATM、AMPK和ULK-1的活化更大、时间更长;这与更大的ATG13S318磷酸化和更大的eIF2subs51磷酸化有关。用[neratinib+帕博西尼+丙戊酸]处理细胞可导致mTOR、AKT和ERK1/2更大、更长的失活时间。三种药物联合使用会延长p70S6K的失活时间，这与我们的mTOR和AKT磷酸化数据一致。三种药物联合使用导致MCL-1和c-FLIP-s表达降低时间延长，这也与死亡受体激活增强有关。在表达突变K-RAS的CT26小鼠结肠癌细胞中也观察到类似的数据。在CT26细胞中，三药联合使用4h后K-RAS蛋白表达显著降低。注意，在[neratinib+帕博西尼]处理的细胞中，4h后K-RAS蛋白呈点状，与生长因子受体的“顶帽”过程类似)。孵育8h后，[neratinib+帕博西尼]及三药联合显著降低K-RAS表达。　　

　　ATM或AMPK的下调显著降低了[neratinib+帕博西尼]和[neratinib+帕博西尼+丙戊酸盐]的致死率。然而，Beclin1或ATG5的抑制比ATM或AMPK的抑制更有效地抑制三种药物联合致死率。即在乱置对照下，丙戊酸钠使[neratinib+帕博西尼]的真实致死率提高了约15%;siATM增强约10%;siAMPK下，微波增强约7%;siBeclin1和siATG5增强约4%。因此，丙戊酸盐增强自噬小体形成的能力对其增强[neratinib+帕博西尼]杀伤作用至关重要。自噬在杀伤中发挥关键作用，特别是自噬通量，溶酶体蛋白酶cathepsinB的降低也可以防止两药和三药联合杀伤。FADD的敲除或c-FLIP-s的过表达也有类似的保护作用。通过细胞表面定位增加判断，[neratinib+帕博西尼]激活的CD95在丙戊酸盐作用下显著增强。最后，证实了死亡受体信号在我们系统中的重要性，CD95的敲除显著降低了丙戊酸盐增强[neratinib+帕博西尼]致死率的能力。　　

　　最后，利用PDX卵巢癌分离物，我们确定了neratinib、帕博西尼（哌柏西利）和丙戊酸之间的相互作用。[丙戊酸+帕博西尼]显著提高了neratinib对尖锐型卵巢癌肿瘤的抗肿瘤作用。H&E染色在正常组织(脑、肺、心、肝、脾、结肠和肾脏)未见明显毒性反应。我们的发现表明，HDAC抑制剂丙戊酸钠是一种具有成本效益的药物，可以提高neratinib和帕博西尼的疗效。详情请扫码咨询：