HCC细胞对索拉非尼的不敏感性严重限制了癌症治疗的结果。在我们的研究中，HepG2细胞在LI72h、MI72h和HI72h3个浓度索拉非尼的长期作用下存活，HepG2细胞对索拉非尼不敏感。这些存活的细胞不属于HepG2耐索拉非尼细胞，它是通过不断增加索拉非尼浓度暴露HepG2细胞而建立的。因为HI72h细胞分化后的子细胞对索拉非尼的IC50值类似于未处理的HepG2细胞在索拉非尼处理前的IC50值。为了探索潜在的生存机制，我们首次对不同浓度索拉非尼对癌细胞的胞内效应进行了大规模的蛋白质组学分析。
采用基于tmt的定量方法，在LI72h、MI72h和HI72hHepG2细胞中共鉴定和定量了4100个蛋白；’STEM分析揭示了两个最富集的星团，索拉非尼在3种类型的细胞中显著且浓度依赖性地上调了520个蛋白。KEGG通路对520个蛋白的显著定量变化分析表明，其中80个蛋白参与了最可靠的术语“代谢通路”，主要与中心碳代谢有关，包括碳代谢、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、TCA循环等。具体地说，这80个蛋白质的蛋白质相互作用分析表明，大多数的33个蛋白质之间的相互作用与线粒体和12的蛋白质参与OXPHOS，包括等单元CI(NDUFA5、NDUFB8NDUFS3，NDUFS8和NDUFV2)，人民共和国(SDHB)CIII(UQCRFS1)，复杂的IV(文明)(COX6C和COX6B1)，和简历(ATP5B，ATP5C1和ATP5H)。
对520个调控蛋白的GO富集分析一致显示102个线粒体蛋白显著富集(p=7.77E-21)。通过基于这520个蛋白的转录因子(TF)预测，我们发现了几种典型的线粒体基因上游调控因子，如NRF1和YY1(SupplementaryFigure2B，2C)，可能与索拉非尼治疗后蛋白表达响应增加有关。因此，这些蛋白质组学结果表明，在LI72h、MI72h和HI72hHepG2细胞中，102个线粒体蛋白呈递增性上调；’具体来说，这些蛋白中有12个与线粒体OXPHOS密切相关，并可能在索拉非尼的生存机制发展中发挥作用，以避免抗肿瘤活性。
因此，我们推测HCC细胞在高剂量索拉非尼的抗肿瘤作用下可能通过重塑线粒体呼吸功能而存活。基于这个假设，我们评估的影响与索拉非尼long-term-treatment细胞线粒体的呼吸功能，心肌梗死和嗨细胞48h和72h。尽管许多upregulation线粒体蛋白质索拉非尼治疗后，嗨肝癌细胞的细胞线粒体呼吸功能明显，非常有说服力地抑制，这个发现是完全无法预料的。
值得注意的是，即使将HI72h细胞维持在最低的基础呼吸状态，几乎等于最大的呼吸水平，细胞继代培养后仍保持了附着和增殖的能力。HI72h细胞分化的子细胞线粒体呼吸功能与未处理的HepG2细胞相似(数据未显示)。由于我们的定量蛋白质组学数据显示，在LI72h、MI72h和HI72h细胞中线粒体呼吸链蛋白水平呈浓度依赖性升高，这一矛盾提出了线粒体呼吸链蛋白上调的可能，以补偿线粒体功能受到的严重抑制。Eimre等人报道，在wfs1缺陷的小鼠肌肉中，也出现了类似的现象，线粒体蛋白增加，这可能弥补了线粒体质量的下降。
为了对ETC进行更详细的研究，我们使用高分辨率呼吸测定法来阐明线粒体呼吸抑制或代偿的可能机制。LI、MI和HI细胞实验中索拉非尼的浓度与临床[34]相关；’因此，我们研究了索拉非尼在IC20、IC50或IC80浓度下短期治疗对HepG2细胞的影响。索拉非尼短期治疗显著抑制了CI的OXPHOS容量和ETS容量，且呈浓度依赖性，最大抑制率分别为59.7%和79.2%(p<0.01)。
Bull等人使用一种方法测定NADH氧化为NAD+，这间接反映了人神经母细胞瘤细胞的CI活性，表明索拉非尼损害了CI活性。需要特别指出的是，在我们的研究中，索拉非尼表现出了一种快速而直接的抑制CI功能的作用，类似于鱼藤酮，很可能是通过抑制NADH脱氢酶(CI)到辅酶Q的电子传递。此外，我们还发现索拉非尼是一种解偶联剂；’本研究中有两类证据支持这一结论。首先，与Seahorse的质子泄漏增加结果一致，与时间匹配的对照组相比，短期使用浓度相当于IC80的索拉非尼，CI的泄漏呼吸增加了4倍，泄漏呼吸增加了2倍。
漏呼吸主要补偿ATP合酶抑制后的质子漏。其次，在浓度为IC80的索拉非尼处理15分钟的HepG2细胞中，为获得最大解偶联能力而滴入的FCCP的最佳浓度降低了2倍。据报道，某些线粒体解偶联剂能够通过促进线粒体内膜的质子泄漏来减少OXPHOS的偶联，从而干扰依赖于CIV和CV之间偶联的ATP生产。简而言之，索拉非尼靶向线粒体CI，解偶联线粒体OXHPOS，从而全面抑制OXHPOS功能。
与选择性抑制CIOXPHOS容量不同，索拉非尼以浓度依赖的方式诱导了CIIOXPHOS容量的代偿性增加。这种补偿与蛋白质组学分析中CII组分(SDHB)的上调相一致，并可能在保护癌细胞免受索拉非尼抗肿瘤作用中发挥重要作用。呼吸链线粒体CII具有连接ETC和TCA循环的双重作用，CII抑制剂通过其促凋亡和抗血管生成的潜力显示出良好的抗肿瘤活性；’该化合物已被证明与抗癌药物协同作用，诱导癌细胞的多效性反应。
考虑到索拉非尼对OXPHOS和ETS功能的严重抑制，尤其是在高剂量索拉非尼处理的情况下，大多数代偿性表达的线粒体蛋白预期无法支持呼吸和能量供应。糖酵解是另一个主要的生物能量途径，参与填补ATP生产的空白。OCR和ECAR分别被认为是OXPHOS和糖酵解的指标，OCR/ECAR的相对比值常被用来作为潜在代谢转换的指标。通常，OCR/ECAR比值大于1表明倾向于线粒体OXPHOS，而低于1则表明倾向于糖酵解。从能量代谢的角度，索拉非尼显著，LI72hconcentration-dependently抑制糖酵解代谢MI72hHI72h细胞证实索拉非尼是一种有效的全球能量代谢的抑制因子在肝癌细胞。
然而，HI72h细胞显示显著降低基底OCR值相比HI48h细胞(HepG2和Huh7细胞减少77.2%和43.8%，分别)，但仍等于ECAR价值。我们还观察到，与HI48h细胞相比，HI72h细胞表现出更低的基础OCR/ECAR比值，表明HI细胞更依赖糖酵解来维持其能量需求。KEGG通路分析一致显示，参与糖酵解途径的某些蛋白浓度依赖性地上调。之前有研究报道，索拉非尼在浓度小于10μM的HepG2细胞中处理24h后抑制OXPHOS，但不能抑制糖酵解，证实了线粒体功能是索拉非尼优先靶点的观察。
因此，我们可以合理假设，HI72h细胞从线粒体OXPHOS代谢转换为糖酵解，从而避免了高剂量索拉非尼的抑制作用，代谢重编程能够提供基本的ATP支持肿瘤细胞生存。因此，为了证实代谢重编程是否支持不敏感细胞的生存，我们研究了2-DG联合索拉非尼长期治疗的效果。正如预期的那样，2-DG使肝癌细胞对索拉非尼诱导的细胞死亡敏感，并与索拉非尼协同作用。甚至解释了最近观察到索拉非尼和HK2沉默的联合使用增加了HCC细胞死亡，并协同抑制肿瘤生长的机制。
综上所述，我们首次证明索拉非尼，一种fda批准的肝癌药物，通过两种不同的机制显著抑制人肝癌细胞线粒体OXPHOS的总体水平:直接靶向ci连接的电子传递和OXPHOS能力，并作为一种潜在的解藕剂阻断与呼吸耦合的ATP产生。然而，即使在最高浓度索拉非尼的药物长期治疗下，仍存在一定数量的HCC细胞对索拉非尼不敏感，这些细胞通过代谢重编程存活，包括广泛的生物能量途径蛋白代偿调节。首先，主要的重编程被确定为大量线粒体蛋白的代偿性增加，尤其是在ETS组分中，包括CI亚基表达水平的维持和CII丰度和活性的增加，这可能会绕过索拉非尼对CI电子传递的抑制。
另一个机制是当OXPHOS受到高剂量索拉非尼的抑制时，代谢从OXPHOS转变为糖酵解，从而维持能量供应，支持癌细胞生存。在索拉非尼治疗下ETS组分的矛盾敏感性和稳定的剂量依赖性补偿，尤其是复合物I和II亚基的上调，可以作为预测索拉非尼治疗药物反应和预后的可靠指标。索拉非尼（多吉美）在老挝只卖几百块钱一盒，详情请扫码咨询：
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