威托克/维奈托克在慢淋中显示了显著的疗效

　　维奈托克（威托克）是一种一流的BCL2高特异性拮抗剂，在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中显示了显著的疗效，显著清除了微小残留疾病(MRD)。与联合治疗相比，用维奈托克（威托克）作为单一药物连续治疗2-3年后可导致多达50%的患者出现难治性症状，这在大量预先治疗的CLL患者的试验中有报道。最近，对维奈托克（威托克）的潜在耐药机制被确认为BCL2.5中的获得性突变，在这里，我们独立证明了BCL2突变G101V出现在四分之三的维奈托克（威托克）患者中。此外，我们还在其中一例维奈托克（威托克）耐药患者中发现了第二个未报道的BCL2突变D103Y。　　

　　从2013年10月至2015年4月，我们中心在关键的二期试验M13-9824中，连续采用维奈托克（威托克）治疗了15例重度预处理、染色体17p缺失的高危CLL患者。随着时间的推移，大多数患者由于各种原因停止了治疗，但是在接受维奈托克（威托克）治疗超过3年的患者中，有4人出现进行性CLL。　　

　　其中一名患者是一名在2004年被诊断为CLL的78岁妇女。2013年2月，她在接受了两种不同的化疗(免疫)治疗后第二次复发。遗传分析显示没有突变的IGHV(V2-05)和染色体17p的缺失。单剂维奈托克（威托克）治疗纵隔淋巴结缩小和血液计数正常化取得了部分反应。然而，2016年3月(治疗第120周)的CT常规扫描显示淋巴结病变增加，淋巴结活检和骨髓活检确诊为CLL。由于进展无症状，患者选择继续使用维奈托克（威托克），并根据方案进行密切监测。2017年2月出现盗汗、疲劳，伴中性粒细胞减少、血小板减少。正电子发射断层扫描(PET)-CT扫描证实脾肿大和全身淋巴结病与中度氟去氧葡萄糖摄取。脾脏切割针活检和骨髓活检证实CLL浸润，没有Richter转化的证据。外周血的流式细胞术、荧光原位杂交和IGHV测序证实CLL具有基线特征(CD19+CD5+CD23+，缺失17p)，尽管淋巴细胞计数仍然很低(1.2g/L)。该患者后来改用依鲁替尼治疗，但仅几天后就死于中性粒细胞减少症期间的肺炎。　　

　　为了识别维奈托克（威托克）耐药形成的基因组变异，我们对不同时间点的非恶性和肿瘤样本进行了全外显子组测序。　　

　　收集肿瘤样本，在基线(2013年11月)、首次进展(2016年3月)和最终分期(2017年2月)时富集CD19+细胞以提高肿瘤纯度。序列分析显示，在难治性CLL发生时间点的脾脏和骨髓样本中，BCL2存在误义突变，但在基线CLL样本和外周血CD19选择阴性的非恶性细胞中均不存在。经预测，302密码子获得变异将取代101位甘氨酸的氨基酸为缬氨酸(G101V)。靶向扩增子测序证实了所有难治性CLL组织中均存在G101VBCL2变异，包括2016年的骨髓样本以及2016年和2017年的外周血样本，但在基线(0/568reads)和非恶性细胞(0/403reads)中均不存在。G101V的变异等位基因分数(VAF)在骨髓中从2016年的9%增加到2017年的16%，在脾脏中最高，为25%。在顽固性疾病发生时，在脾脏和骨髓样本中，BCL2突变显示了所有新变异或累积变异的最高增加。　　

　　为了证明在我们的无偏全外显子组测序(WES)方法中，BCL2G101V的获得与耐药性相关，我们想通过对另外3名获得性对维奈托克（威托克）耐药患者的靶向下一代测序(NGS)来评估获得性BCL2突变的作用。在两个病例中，我们证实了在难治性CLL疾病阶段存在BCL2G101V，但在治疗开始之前没有。　　

　　令人惊讶的是，我们在患者3的BCL2中发现了额外的获得性变异。第二个变种、BCL2D103Y被确认在两个独立的时间点与两个独立的门店化验维奈托克（威托克）39个月治疗后，每次在外周血VAF的7%增加到18%。病人细胞后的计算显示，BCL2G101V变异除了D103Y。值得注意的是，BCL2G101V变异在39个月时检测不到，仅在VAF为14%的最新时间点出现。重要的是，两个BCL2变种的读值不同，表明它们出现在两个不同的亚无性系中，在不同的发病时间点和不同的生长速度，可能表明了不同的克隆适应度。　　

　　对546例维奈托克（威托克）-naiveCLL患者进行相同的靶向下一代测序(tNGS)分析，均未发现BCL2变异体G101V和D103Y。我们还对4名患者进行了测序，这些患者在接受了有时限的维奈托克（威托克）治疗后复发，但没有发现任何获得性BCL2变异。　

　　与G101突变相比，D103突变是BCL2BH3结合袋的一部分，是BCL2和BCL-XL之间BH3结合域内少数不同的氨基酸之一。103位的天门冬氨酸是维奈托克（威托克）与BCL2结合的重要氨基酸，该结合的亲和力是基于与维奈托克（威托克）的吲哚环上的氢键。酪氨酸对天冬氨酸的D103Y替代导致较重的氨基酸延伸到结合袋中，从酪氨酸侧链的三种不同构象状态可以看出，这说明了这种异常酪氨酸的范围及其抑制维奈托克（威托克）结合的潜力。　

　　相反，101位的氨基酸位于由BH3结合袋组成的关键的阿尔法螺旋的对位。从甘氨酸到缬氨酸的突变导致球形BCL2蛋白内部存在较大的侧链。G101V的动态建模导致了构象的转移，这是由于邻近残基E152、V148、F104和Y18的过度拥挤导致的，这些残基距离仅在1.94-6.23a之间，并且存在于BH3的部分结合袋中。残基F104是模拟的维奈托克（威托克）对接位点中的一个关键结构角色，与G101V突变非常接近。这些结构观察结果解释了G101V突变如何损害最近在玻璃中显示的维奈托克（威托克）的结合亲和力。　　

　　在我们的病例系列中，四分之三的耐药CLL患者检测到这些耐药变异，并与Blombery等人最近发表的研究结果一致，是在超过2.5年的成功治疗后发现的。我们可以证明，至少有两名患者的突变在需要后续治疗的一年前就可以检测到。有趣的是，淋巴细胞增多不是疾病进展的主要特征，而是血小板减少和中性粒细胞减少，提示抵抗细胞对骨髓浸润有亲和力。事实上，患者1的骨髓和脾脏的等位基因在任何时间点都比外周血中的高，而另外两个患者没有活检。与Blombery等人的进一步一致表明，BCL2突变变体的亚克隆特征具有可比性，且低于50%，这意味着由于BH3结合袋竞争条件的改变而导致克隆适应度降低，从而存在进一步的抗性机制。　　

　　这可能是由于抗凋亡分子保留与G101VBCL2的结合，而D103Y可能阻碍抗凋亡蛋白与BCL2的结合，导致适应度降低。这一理论得到了最近发表的原发细胞和G101V变体细胞系的功能分析的支持，这些分析显示G101V变体与维奈托克（威托克）和navitoclax的结合亲和力较低，但仅略微影响BIM和BAX的结合。说明了可能的根本原因：应用程序引起的定向部队笨重缬氨酸残留导致预测与小的轻微转变BCL2α螺旋的但有效的在几个关键氨基酸构象变化预计将减少维奈托克（威托克）的绑定。　　

　　具体替换所有报告抗慢性淋巴细胞白血病101例甘氨酸缬氨酸，而不是为其他残留物可以引起的错义变种相同的密码子，如导致替换G101丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺也暗示的非常具体的分子机制减少维奈托克（威托克）绑定。缬氨酸是唯一一个在靠近BCL2螺旋骨架的地方有突出的大甲基团的氨基酸，它提供了螺旋结构的稳定延伸并允许螺旋位移。BCL2螺旋之间的这种转移可能比BH3口袋内的错义突变更耐受性，因为后者可能阻碍其他BH3配体的结合。然而，通过D103Y，我们鉴定出了一个主要影响与维奈托克（威托克）结合的变体，该变体可能是基于其在p4位点上吲哚环的相互作用，这将需要更详细的研究。维奈托克（威托克）怎么购买老挝东盟版本的？详情请扫码咨询：