奥希替尼联合蟾毒灵显著抑制了细胞的生存能力

　　蟾毒灵增强了奥希替尼诱导的对奥希替尼耐药的NSCLC细胞存活率的降低

　　PC-9和HCC827细胞对奥希替尼表现出较高的敏感性。然而，即使在高浓度的1 μM，奥希替尼仅略有减少的可行性中冲/或HCC827和/或细胞。接下来，我们研究蟾毒灵是否能增强奥希替尼诱导的耐药NSCLC细胞存活率下降。蟾毒灵以剂量依赖的方式降低了对奥希替尼耐药细胞的细胞存活率。

　　令人惊讶的是，奥希替尼联合蟾毒灵显著抑制了细胞的生存能力，每个药物浓度的联合治疗CI<0.6。因此，蟾毒灵和奥希替尼在降低细胞活力方面具有较强的协同效应。长期实验结果也显示，奥希替尼与蟾毒灵联合使用明显抑制了对奥希替尼耐药细胞的定植形成能力。这些结果证实蟾毒灵有效克服了对奥希替尼的耐药。

　　蟾毒灵增强奥希替尼诱导的对奥希替尼耐药的NSCLC细胞凋亡

　　调查是否奥希替尼引发细胞凋亡，中冲，中冲/或HCC827，HCC827/或细胞暴露在奥希替尼24 h。采用AnnexinV/7-AAD和westernblotting检测细胞凋亡。我们观察到，在PC-9和HCC827细胞中，奥希替尼诱导细胞强劲凋亡，并增加了裂解的PARP和caspase-3的水平，但对奥希替尼耐药细胞的作用不大或没有影响。这些发现与之前的研究结果一致，即奥希替尼失去了诱导耐药NSCLC细胞凋亡的能力。接下来，我们确定蟾毒灵和奥希替尼的联合用药是否会诱导对奥希替尼耐药的NSCLC细胞凋亡。奥希替尼未能在中冲/或诱导细胞凋亡和HCC827/或细胞。有趣的是，与单独使用两种药物相比，蟾毒灵和奥希替尼联合使用显著触发细胞凋亡，并上调了裂解caspase-3和PARP的表达。这些发现进一步证实蟾毒灵有能力克服对奥希替尼的耐药性。

　　奥希替尼联合蟾毒灵能有效抑制对奥希替尼耐药的非小细胞肺癌异种移植瘤的生长

　　为了进一步阐明蟾毒灵是否能在体内恢复对奥希替尼耐药的NSCLC细胞对奥希替尼的敏感性，将PC-9/或细胞注射到裸鼠体内可产生异种移植瘤。体外结果显示，单独使用奥希替尼不能抑制PC-9/或肿瘤的生长，而蟾毒灵和奥希替尼联合使用可以显著抑制这些异种移植物的生长，且不会导致显著的体重减轻。采用TUNEL染色法分析蟾毒灵和奥希替尼诱导的细胞死亡。与对照剂、蟾毒灵和奥希替尼单独使用相比，蟾毒灵和奥希替尼联合使用显著增加了细胞死亡。免疫组化分析也显示，与单独使用蟾毒灵和蟾毒灵相比，奥希替尼和蟾毒灵联合使用时，caspase-3的裂解明显增加。这些结果表明蟾毒灵能够通过诱导细胞凋亡来消除体内对奥希替尼的获得性抗性。

　　蟾毒灵通过下调MCL-1恢复奥希替尼耐药细胞对奥希替尼的敏感性

　　越来越多的证据表明，过表达mcl1可以保护egfr突变的NSCLC细胞免受奥希替尼诱导的凋亡。为了验证这一假设，我们首先进行了直接测序，以确定奥希替尼耐药细胞中EGFR突变位点。EGFRexon20和exon21C797S突变及C797S区域的其他突变未在奥希替尼耐药细胞中检测到，提示除了EGFR基因改变外，还有其他机制介导了对奥希替尼的耐药。接下来，在本研究中，我们确定奥希替尼是否会影响mcl1的表达。如图4A所示，奥希替尼降低了PC-9和HCC827细胞中MCL-1的水平。然而，这些调节并没有在奥希替尼耐药细胞中观察到，因此支持了之前的研究结果，即上调mcl1可降低奥希替尼对egfr突变的NSCLC细胞的致病性。

　　接下来，我们研究蟾毒灵是否通过下调MCL-1增加了奥希替尼的致死率。我们发现蟾毒灵比奥希替尼更能降低耐奥希替尼细胞中mcll-1的表达。为了进一步验证这一结果，PC-9/OR细胞被迫过表达mcll-1。我们观察到，过表达mcl1可以消除蟾毒灵诱导的细胞凋亡。然而，siRNA敲除mcl1促进蟾毒灵诱导的细胞凋亡。总之，这些数据表明蟾毒灵至少部分地通过降低mcl1的水平克服了对奥希替尼的抗性。

　　MEK/ERK/MCL-1通路不参与蟾毒灵介导的对奥希替尼耐药NSCLC细胞中MCL-1的降低

　　在最近的一项研究中，我们发现蟾毒灵至少部分通过蛋白酶体降解诱导了mcl1的减少。在本研究中，我们发现蛋白酶体抑制剂MG132抑制了这些抗性细胞系中MCL-1的降解，挽救了蟾毒灵调控的MCL-1抑制。此外，在奥希替尼或蟾毒灵处理的PC-9/OR和HCC827/OR细胞中，MCL-1的mRNA表达略有增加。与对照组相比，蟾毒灵处理导致PC-9/或细胞中更多的mcll-1泛素化。这些数据表明蟾毒灵通过降解MCL-1逆转了对奥希替尼的抗性。

　　如之前报道的，MEK/erk依赖的mcl1降解调节了egfr突变的NSCLC细胞对奥希替尼的抗性。因此，我们测试蟾毒灵是否通过抑制MEK/ERK/mcl1通路克服对奥希替尼的抗性。奥希替尼没有降低PC-9/OR和HCC827/OR细胞中p-ERK、p-mcl1(Thr163)和mcl1的水平，提示MEK/ERK/mcl1信号给予奥希替尼抗性。在相同的条件下，我们注意到蟾毒灵并没有降低奥希替尼耐药细胞中磷酸化的ERK和mcl1的水平。这些结果表明蟾毒灵诱导的MCL-1的下调并不是通过ERK信号发生的。

　　ku70介导的mcl1过表达诱导egfr突变的NSCLC细胞获得奥希替尼耐药

　　MCL-1过表达也受到去泛素酶的调控。USP9X和Ku70已被鉴定为MCL-1去泛素酶，可从MCL-1蛋白上去除多聚泛素链，提高MCL-1的稳定性。因此，我们确定了USP9X-和ku70介导的mcl1过表达是否是egfr突变的NSCLC细胞中奥希替尼耐药的其他关键机制。我们观察到USP9X的表达没有明显上调，但Ku70的表达在所有的奥希替尼耐药细胞中显著上调。然而，与亲代细胞相比，奥希替尼并没有降低奥希替尼耐药细胞中的Ku70。免疫荧光染色也显示了同样的现象。Ku70pcDNA3.1-Ku70-induced超表达的细胞中冲强劲增加mcl1水平和抑制奥希替尼-induced细胞凋亡。然而，沉默的Ku70Ku70siRNAmcl1水平降低和增强中冲/或细胞的敏感性奥希替尼。这些结果表明Ku70-mediatedmcl1upregulation参与收购阻力在EGFR-mutant奥希替尼NSCLC细胞。

　　蟾毒灵通过抑制Ku70下调对奥希替尼耐药的NSCLC细胞中mcl1的表达

　　接下来，我们研究蟾毒灵是否通过抑制ku70介导的MCL-1过表达来恢复奥希替尼耐药细胞对奥希替尼的敏感性。随着Ku70水平的降低，蟾毒灵治疗后，mcl1的表达也随之降低。蟾毒灵和奥希替尼联合显著降低了HCC827/OR和PC-9/OR细胞中Ku70和mcl1的表达。免疫荧光染色也观察到类似的结果。为了研究蟾毒灵是否通过抑制Ku70下调mcl1，我们在PC-9/OR细胞中诱导了Ku70的异位表达，然后用蟾毒灵处理。过表达Ku70显著挽救蟾毒灵诱导的细胞凋亡和抑制mcl1的表达。此外，免疫沉淀实验显示蟾毒灵降低了Ku70与mcl1的结合水平。此外，与单独使用两种药物相比，联合使用显著下调了NSCLC异种移植组织中mcl1和Ku70的表达。因此，我们证明蟾毒灵通过抑制ku70介导的MCL-1过表达，克服了对奥希替尼的获得性耐药。奥希替尼多少钱一盒？一盒可以吃多久？详情请扫码咨询：