为了研究（S）-克唑替尼（crizotinib）对人NSCLC细胞活力的影响，将NCI-H460、H1975和A549细胞用（S）-克唑替尼处理24小时，并通过MTT测定法测量活细胞数。(S)-克唑替尼降低了 NCI-H460、H1975 和 A549 细胞的活力，IC50值分别为 14.29、16.54 和 11.25 μM。然后我们使用 siRNA 敲低 MTH1 在 NCI-H460 细胞中的表达以确定 (S)-克唑替尼是否通过 MTH1 调节生存能力。如果 (S)-克唑替尼确实通过 MTH1 介导其作用，那么 MTH1 敲低预计将模拟 (S)-克唑替尼。有趣的是，MTH1 的 siRNA 敲低并没有改变单独或在 (S)-克唑替尼治疗后的生存能力。IC50值在有或没有MTH1 siRNA 敲低的情况下几乎相同，表明(S)-克唑替尼对NSCLC 生存能力的影响与MTH1 无关。
我们接下来确定了 (S)-克唑替尼后细胞活力的降低是否是由于细胞凋亡。用膜联蛋白 V/碘化丙啶 (PI) 对细胞进行染色显示，在 (S)-克唑替尼暴露后，所有三个 NSCLC 细胞系均诱导细胞凋亡。为了证实这一发现，我们检查了 NCI-H460 和 H1975 中细胞凋亡相关蛋白的水平。我们的结果表明，（S）-克唑替尼降低了 B 细胞淋巴瘤 2（Bcl-2）。此外，Bcl-2 相关蛋白 x (Bax) 未改变（H460 细胞）或显示增加（H1975 细胞）。在任何一种情况下，Bcl-2: Bax 比值的降低都意味着在 (S)-克唑替尼治疗后诱导细胞凋亡。
先前的研究报告说，NSCLC 中 ROS 的产生能够触发细胞凋亡。克唑替尼还会增加卵巢癌细胞和肺泡细胞的氧化应激，因此，我们确定了 (S)-克唑替尼治疗后 NSCLC 细胞的凋亡和活力降低是否涉及细胞内 ROS 水平的变化。我们通过 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 染色测量了细胞中 ROS 的产生。DCFH-DA 经历水解，然后 ROS 介导的氧化为荧光状态，提供细胞中 ROS 水平的量度。我们还测量了一氧化氮水平作为氧化应激的额外读数 通过 4-amino-5-methylamino-2',7'-difluorofluorescein diacetate (DAF-DA)。用 (S)-克唑替尼处理 NCI-H460 细胞导致 ROS 水平（DCF 和 DAF 水平）的快速、剂量依赖性增加。
在 A549 和 H1975 细胞中获得了相同的结果。然后我们在 MTH1 siRNA 转染后检测细胞以确定 MTH1 缺陷是否模拟 (S)-克唑替尼治疗。我们发现 MTH1 敲低在有或没有（S）-克唑替尼治疗的情况下都不会改变 ROS 水平。然而，如预期的那样，用 N-乙酰半胱氨酸（ROS 清除剂；NAC，5 mM）和谷胱甘肽（GSH，5 mM）对细胞进行预处理显着降低了（S）-克唑替尼诱导的 DCF 荧光增加（图 2）。以及附加文件1：图 S1b、S1c)。有趣的是，用超氧化物歧化酶 (SOD) 预处理未能减少由细胞暴露于 (S)-克唑替尼引起的 DCF 荧光。这些结果表明（S）-克唑替尼诱导的 ROS 生成与 MTH1 改变无关。结果还指出涉及过氧化氢和一氧化氮，但不涉及超氧阴离子。
我们接下来想知道（S）-克唑替尼诱导的 ROS 是否介导细胞凋亡。我们在暴露于 (S)-克唑替尼后，使用或不使用 NAC、GSH 和 SOD 预处理后，用膜联蛋白 V/PI 染色细胞。根据我们上面的 ROS 水平发现，我们预计 NAC 和 GSH 会消除（S）-克唑替尼诱导的细胞凋亡，但不会消除 SOD。事实上，用 NAC 和 GSH 预处理细胞显着抑制了（S）-克唑替尼诱导的细胞凋亡。正如预期的那样，用 SOD 预处理未能保护细胞免受（S）-克唑替尼诱导的细胞凋亡。这些变化与细胞中 Bcl-2 蛋白的水平平行）。现在克唑替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。
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