克唑替尼(Crizotinib)联合依维莫司治疗淋巴瘤

　　间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL) 是一种罕见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤，其中超过 50% 的病例具有异常的核磷蛋白 (NPM)-间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 融合蛋白。雷帕霉素 (mTOR) 抑制剂依维莫司的机制靶点和 ALK 抑制剂克唑替尼（Crizotinib）都已在 ALK 阳性癌细胞系中显示出有希望的抗肿瘤活性。然而，尚未研究它们的组合效果。

　　材料和方法

　　我们评估了依维莫司或克唑替尼在 ALK 阳性 ALCL 细胞系 Karpas 299 和 SU-DHL-1 以及肺腺癌细胞系 NCI-H2228 中的抗增殖作用。

　　结果

　　我们发现，在 Karpas 299 和 SU-DHL-1 细胞中，依维莫司和克唑替尼均以剂量依赖性方式有效抑制细胞生长。这些药剂的组合协同抑制两种细胞系的增殖。克唑替尼下调依维莫司诱导的异常 AKT 和 ERK 磷酸化。在 ALK 阳性 ALCL 细胞中，与单用依维莫司或克唑替尼相比，联合治疗还显着增加了 G0/G1 细胞周期停滞、DNA 损伤和细胞凋亡。在 Karpas 299 异种移植模型中，联合治疗比单一治疗具有更强的抗肿瘤作用，体重没有显着变化。依维莫司和克唑替尼的协同作用也在 ALK 阳性肺腺癌细胞系 NCI-H2228 中重现。

　　结论

　　克唑替尼（Crizotinib）联合依维莫司可协同抑制 ALK 阳性 ALCL 细胞的增殖。我们的结果表明，这种新型组合值得在 ALK 阳性 ALCL 患者中进行进一步的临床开发。

　　先前的研究表明，克唑替尼在抑制 ALK 阳性神经母细胞瘤中的 mTOR 信号传导方面的作用有限。假设同时靶向 NPM-ALK 和 mTOR 的策略可能能够克服每种单一疗法的局限性是合理的。在这项研究中，我们调查了克唑替尼和依维莫司的组合是否在 ALK 阳性 ALCL 细胞系中发挥协同抗肿瘤活性。还研究了这种联合治疗的生物学作用机制。

　　在这项研究中，依维莫司、mTOR 抑制剂和 ALK 抑制剂克唑替尼的组合在 ALK 阳性临床前模型中显示出协同抗肿瘤活性。我们显示依维莫司增加了 ALK 阳性 ALCL 细胞中的 AKT 和 ERK 磷酸化。克唑替尼与依维莫司联用通过消除依维莫司诱导的异常 AKT 和 ERK 磷酸化显示出协同的细胞毒性。此外，这种联合治疗显着增加了 G0/G1 细胞周期停滞、DNA 损伤和细胞凋亡。此外，这种抗增殖活性可以转化为 ALCL体内异种移植模型。

　　mTOR 信号通路在许多人类癌症中经常失调，包括 ALCL；因此，预计抑制 mTOR 将是治疗多种癌症的有前途的策略。目前，有几种 mTOR 抑制剂正在临床开发中作为抗癌疗法。然而，以前的报道表明，使用雷帕霉素类似物导致AKT和ERK的上调通过几种不同的机制。mTORC1 的主要底物之一 p70S6K 通过反馈机制调节通路，其中 PI3K 被 IRS1 下调抑制。因此，使用下调 p70S6K 的 rapalogs 抑制 mTORC1 导致 PI3K 激活。p70S6K 还通过 Rictor 在 Thr1135 处的磷酸化抑制 mTORC2。因此，rapalogs 对 p70S6K 的下调允许 mTORC2 活性，导致 Ser473 上的 AKT 磷酸化。此外，mTOR 抑制会增加血小板衍生生长因子受体的表达，导致 Ser473 上的 AKT 磷酸化进一步增加。在癌症患者以及体外实验和前列腺癌的临床前模型中，通过 p70S6K-IRS-Ras 通路抑制 mTORC1 也会触发 ERK 激活。在我们的研究中，克唑替尼减弱了依维莫司触发的 AKT 和 ERK 激活。

　　在 ALK 阳性 ALCL 细胞中，异常的NPM-ALK融合基因激活 Ras/ERK、STATs 和 PI3K/AKT 信号通路。克唑替尼在体外和体内均能有效抑制 ALK、AKT、ERK、PLC-γ 和 STAT3 的磷酸化。之前的一份报告显示，两名 ALK 阳性 ALCL 患者在接受克唑替尼治疗后可以快速完全缓解，即使他们之前在 CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松）化疗后复发。另一项克唑替尼单药治疗复发或难治性 ALK 阳性 NHL 患者的临床研究报告总反应率为 91%（11 个中的 10 个），2 年总生存率和无进展生存率分别为 72.7% 和 63.7% 。然而，尽管接受了克唑替尼治疗，很大一部分患者最终还是出现了复发或进展，这可能是由于治疗期间对克唑替尼产生了获得性耐药。在先前针对 ALK 阳性 ALCL 的临床前克唑替尼研究中，Christensen 等人证明克唑替尼在下调磷酸化 AKT（mTOR 的主要上游分子）方面无效，即使在完全抑制磷酸化 ALK 的剂量下也是如此。贝瑞等人表明，虽然克唑替尼消除了 ALK 磷酸化，但它对ALKF1174L/MYCN神经母细胞瘤模型中的AKT、S6K 和 4EBP1 磷酸化几乎没有影响，这导致对克唑替尼的耐药性可能与包括 mTOR 在内的关键信号通路的不完全抑制有关。因此，我们假设，作为与其他化疗药物联合治疗的一部分，克唑替尼可能比单一疗法更有效。

　　至于作用机制，克唑替尼（Crizotinib）与 ALK 酶的 ATP 结合位点结合，随后阻止自身磷酸化。与我们的蛋白质印迹结果一致，Megiorni 等人证明克唑替尼治疗抑制了横纹肌肉瘤细胞中 ALK、AKT 和 ERK 的磷酸化。然而，与克唑替尼治疗相关的这些分子的总蛋白表达水平没有变化 。至于依维莫司，它通过与亲免素 FK 结合蛋白 12 结合而发挥作用，从而抑制 mTOR 的激活。与我们的实验数据一致，Xu 等人证明依维莫司治疗弥漫性大 B 细胞淋巴瘤细胞系显着降低 AKT (Thr308)、mTOR (Ser2448)、p70S6K 和 4E-BP-1 (Thr37/46) 的磷酸化，而总蛋白表达水平没有相应变化这些分子。这些数据表明这两种靶向药物都没有在转录水平上起作用。因此，这两种靶向药物通过降低靶分子的磷酸化作用对信号通路发挥抑制作用。

　　我们的结果表明，一方面，这种新型组合的协同抗增殖作用表明，ALK 抑制可以通过抑制下游 PI3K/AKT 和 Ras/ERK 信号通路来帮助克服 ALK 阳性 ALCL 细胞中的依维莫司耐药性。此外，依维莫司对 mTORC1 和 p70S6K 下调的影响通过添加克唑替尼得到加强。另一方面，克唑替尼对 mTOR 磷酸化的影响较小，尤其是对 AKT 的下游靶标 Ser2448。克唑替尼的这种局限性可以通过添加依维莫司来克服。在我们测试的三个 ALK 阳性细胞系中，添加到克唑替尼中的依维莫司进一步均匀地降低了 mTOR 磷酸化。最近，克唑替尼和另一种 mTOR 抑制剂替西罗莫司之间的协同作用，Redaelli 等人报道了在 ALK 阳性 ALCL 细胞系中的。在他们的研究中，联合治疗抑制了体外和体内的肿瘤生长，以及在 G0/G1 期出现明显的细胞周期阻滞，这与我们的研究一致。此外，我们的研究强调了 ALK 和 mTOR 抑制剂的协同抗肿瘤作用是由增强的细胞凋亡介导的详细机制，这是由于有效抑制 mTOR 信号传导的上游和下游。这些结果表明，联合治疗可以克服抗 ALK 或抗 mTOR 单药治疗的局限性。然而，依维莫司或克唑替尼对 4E-BP1 磷酸化的影响在所测试的细胞系中并不一致。之前的一项研究表明，雷帕霉素可以在 6 小时内诱导 4E-BP1 磷酸化，尽管最初在 3 小时内被抑制。克唑替尼还可以在 ALK 阳性肺癌细胞中诱导 4E-BP1 磷酸化，尽管其确切机制尚不清楚。克唑替尼和依维莫司的组合没有改变 Karpas 299 细胞中的 4E-BP1 磷酸化，而它显着降低了 SU-DHL-1 和 NCI-H2228 细胞中的 4E-BP1 磷酸化。在以前的研究使用肺癌细胞，雷帕霉素诱导的4E-BP1磷酸化可以通过BKM120（PI3K抑制剂）或BEZ235（一个PI3K / mTOR的双激酶抑制剂）来取消执行的处理。因此，推测 PI3K 抑制可能适用于克服克唑替尼和依维莫司联合治疗的局限性。

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