克唑替尼Crizotinib对mTOR磷酸化的影响较小

　　在这项研究中，依维莫司，mTOR抑制剂和ALK抑制剂克唑替尼的组合在ALK阳性临床前模型中显示出协同的抗肿瘤活性。我们显示依维莫司增加ALK阳性ALCL细胞中的AKT和ERK磷酸化。克唑替尼与依维莫司合用可通过消除依维莫司引起的异常AKT和ERK磷酸化而显示出协同的细胞毒性。此外，这种联合治疗显着增加了G0/G1细胞周期停滞，DNA损伤和细胞凋亡。而且，这种抗增殖活性可以转化为ALCL体内异种移植模型。　　

　　mTOR信号传导途径失调经常在许多人类的癌症，包括ALCL；因此，预期抑制mTOR将是治疗多种癌症的有前途的策略。当前，有几种mTOR抑制剂正在作为抗癌疗法进行临床开发。然而，以前的报道表明，使用雷帕霉素类似物导致AKT和ERK的上调通过几种不同的机制[mTORC1的抑制]。mTORC1的主要底物之一p70S6K通过反馈机制调节该途径，其中PI3K被IRS1下调抑制。因此，使用rapalogs抑制mTORC1会下调p70S6K，从而导致PI3K激活。p70S6K还通过在Thr1135处使Rictor磷酸化来抑制mTORC2。因此，rapalogs下调的p70S6K允许mTORC2活性，导致Ser473上的AKT磷酸化。此外，mTOR抑制作用会增加血小板衍生的生长因子受体的表达，从而导致Ser473上的AKT磷酸化进一步增加。在癌症患者中，mTORC1通过p70S6K-IRS-Ras途径的抑制以及体外实验和前列腺癌的临床前模型也触发了ERK的激活。在我们的研究中，克唑替尼减弱了依维莫司触发的AKT和ERK激活。　　

　　在ALK阳性ALCL细胞中，异常的NPM-ALK融合基因激活Ras/ERK，STAT和PI3K/AKT信号通路。克唑替尼在体外和体内均有效抑制ALK，AKT，ERK，PLC-γ和STAT3的磷酸化。先前的一份报告显示，即使先前曾在CHOP（环磷酰胺，阿霉素，长春新碱和泼尼松）化疗后复发，克唑替尼治疗后，两名ALK阳性ALCL患者也可以迅速完全缓解。克唑替尼单药治疗复发或难治性ALK阳性NHL患者的另一项临床研究报告，总缓解率为91％（11分之10），两年总生存率和无进展生存率分别为72.7％和63.7％。然而，尽管进行了克唑替尼治疗，但仍有相当一部分患者最终出现复发或进展，这可能是由于在治疗期间对克唑替尼产生了获得性耐药。Christensen等人先前在ALK阳性ALCL的临床前克唑替尼研究中。证明了克唑替尼在下调磷酸化AKT（mTOR的主要上游分子）方面无效，即使在完全抑制磷酸化ALK的剂量下也是如此。Berry等。表明克唑替尼消除了ALK磷酸化，但对ALKF1174L/MYCN神经母细胞瘤模型中的AKT，S6K和4EBP1磷酸化影响很小，从而得出结论：对克唑替尼的耐药性可能与对关键信号通路（包括mTOR）的不完全抑制有关。因此，我们假设克唑替尼可能比单药疗法更有效地与其他化疗药物联合使用。　　

　　至于作用机理，克唑替尼与ALK酶的ATP结合位点结合，从而防止自身磷酸化。与我们的蛋白质印迹结果一致，Megiorni等人。证明克唑替尼治疗可抑制横纹肌肉瘤细胞中ALK，AKT和ERK的磷酸化。然而，与克唑替尼治疗相比，这些分子的总蛋白表达水平没有变化。至于依维莫司，它通过与亲免蛋白FK结合蛋白12结合而起作用，因此抑制了mTOR的活化。与我们的实验数据相符。证明依维莫司治疗弥散性大B细胞淋巴瘤细胞系可显着降低AKT（Thr308），mTOR（Ser2448），p70S6K和4E-BP-1（Thr37/46）的磷酸化，而总蛋白表达水平没有相应的变化这些分子。这些数据表明两种靶向试剂均未在转录水平上起作用。因此，这两种靶向剂通过减少靶分子的磷酸化而对信号传导途径产生抑制作用。　　

　　我们的结果表明，一方面，这种新型组合的协同抗增殖作用表明，ALK抑制作用可以通过抑制下游PI3K/AKT和Ras/ERK信号通路来帮助克服ALK阳性ALCL细胞的依维莫司耐药性。此外，依维莫司对克唑替尼的作用增强了对mTORC1和p70S6K下调的作用。另一方面，克唑替尼对mTOR磷酸化的影响较小，特别是对Ser2448（后者是AKT的下游靶点）的影响较小。克唑替尼的这一局限性可以通过添加依维莫司来克服。在我们测试的三个ALK阳性细胞系中，添加到克唑替尼的依维莫司进一步均匀地降低了mTOR磷酸化。最近，克唑替尼与另一种mTOR抑制剂替西罗莫司之间具有协同作用，Redaelli等人已经报道了在ALK阳性ALCL细胞系中存在的抗肿瘤活性。在他们的研究中，联合治疗在体外和体内均抑制肿瘤生长，以及在G0/G1期的一个尖锐的细胞周期阻滞，这与我们的研究一致。　　

　　此外，我们的研究强调了详细的机制，即由于有效抑制mTOR信号上游和下游，ALK和mTOR抑制剂的协同抗肿瘤作用是由增强的细胞凋亡介导的。这些结果表明，通过联合治疗可以克服抗ALK或抗mTOR单一疗法的局限性。然而，依维莫司或克唑替尼对4E-BP1磷酸化的影响在所测试的细胞系中并不一致。先前的研究表明，雷帕霉素可在6小时内诱导4E-BP1磷酸化，尽管在3小时内有初步抑制作用。克唑替尼还可以在ALK阳性肺癌细胞中诱导4E-BP1磷酸化，尽管其确切机制尚不清楚。克唑替尼和依维莫司的组合不会改变Karpas299细胞中的4E-BP1磷酸化，而显着降低SU-DHL-1和NCI-H2228细胞中的4E-BP1磷酸化（无花果2B和和3C）。在以前的研究使用肺癌细胞，雷帕霉素诱导的4E-BP1磷酸化可以通过BKM120（PI3K抑制剂）或BEZ235（一个PI3K/mTOR的双激酶抑制剂）来取消执行的处理。因此，假设PI3K抑制可能适用于克服克唑替尼和依维莫司联合治疗的局限性。　　

　　先前的研究表明，crizotinib可以诱导ALK阳性ALCL细胞中的G0/G1阻滞，这与我们的结果一致。值得注意的是，依维莫司在克唑替尼中的添加显着增加了G0/G1人群。根据这一发现，细胞周期蛋白D1被联合治疗显着下调。在本研究中，并在以前的报告，这两个雷帕霉素类似物和在ALK阳性ALCL细胞[克里唑替尼诱导的细胞凋亡。在我们的研究中，克唑替尼和依维莫司的组合显着增加了Karpas299细胞和SU-DHL-1细胞中膜联蛋白V染色的人群。此外，该组合增加了γ-H2A.X的表达以及PARP和caspase3的裂解，与DNA损伤和凋亡增加有关。联合治疗后，在Karpas299异种移植模型中还观察到凋亡增强，免疫组织化学中更强的TUNEL染色和Westernblot中PARP裂解的增加证明了这一点。两者合计，我们的结果表明联合治疗促进G0/G1细胞周期停滞，DNA损伤和细胞凋亡。　　

　　已经在多种癌症中鉴定出了几种ALK融合基因，例如肺腺癌，炎性肌成纤维细胞瘤和肾细胞癌。因此，我们推测我们的发现可以应用于其他携带ALK融合基因的癌症。我们在ALK阳性肺腺癌细胞系中测试了这一假设。克唑替尼和依维莫司的组合在NCI-H2228细胞中显示出协同的细胞毒性作用。另外，联合治疗有效地消除了PI3K/AKT和mTOR信号传导途径，而对Ras/ERK信号传导途径的影响很小。该结果表明，该组合可能是其他具有ALK融合基因的癌症的有效治疗策略。　　

　　我们的体外结果表明，依维莫司和克唑替尼的组合通过抑制ALK的下游信号传导途径表现出协同的抗增殖活性。但是，这种新型组合的临床翻译潜力鼓励进行体内验证。在我们的Karpas299鼠模型中，与单药治疗组相比，在联合治疗组中观察到了肿瘤体积的增强增强，而小鼠的体重却没有显着变化。　　

　　在体外和体内实验中，crizotinib和依维莫司的组合均能协同抑制ALK阳性ALCL细胞的增殖。克唑替尼抑制依维莫司诱导的异常AKT和ERK磷酸化，比依维莫司单药更有效地抑制mTOR的活性，导致G0/G1细胞周期停滞，DNA损伤和凋亡增加。因此，在ALK阳性的ALCL中有必要使用crizotinib和依维莫司的组合进行进一步的临床试验。我们建议这种新颖的组合可以用于改善ALK阳性ALCL患者的治疗效果。详情请扫码咨询：