达拉非尼Dabrafenib对黑素瘤细胞的细胞毒性作用

　　自噬在癌症化学疗法中的保护作用越来越引起人们的关注。在我们的研究中，我们首先检查了达拉非尼（Dabrafenib）是否会触发黑色素瘤细胞的自噬。转染了GFP-MAP1LC3报告质粒的A375和MEL624细胞用达拉非尼（100nM）处理24小时。然后观察并在共聚焦显微镜下评估GFP-LC3点的形成。达拉非尼治疗后发现密集的LC3阳性小点。与上述结果一致，Western blot分析显示达拉非尼以剂量依赖性方式显着激活自噬信号传导。为了进一步证明自噬在黑色素瘤细胞对达拉非尼敏感性中的作用，我们比较了单独用达拉非尼，与达拉非尼和自噬抑制剂，3-MA或CQ共同治疗的治疗。我们发现抑制自噬会增强达拉非尼在黑素瘤细胞中的细胞毒性。

　　已知miR-26a在某些类型的癌症中被下调，包括结肠直肠癌，皮肤鳞状细胞癌和成视网膜细胞瘤。我们试图确定在用达拉非尼治疗后黑色素瘤细胞中miR-26a和HMGB1的表达。用达拉非尼处理A375和MEL624细胞，并通过qPCR评估miR-26a和HMGB1的水平。与上述数据一致，在达拉非尼治疗后，蛋白水平的HMGB1表达也显着增加。结果表明，miR-26a明显下调，而HMGB1上调与达拉非尼治疗时。

　　为了证实miR-26a对黑色素瘤自噬的抑制作用，首先用对照miRNA或miR-26a模拟物转染细胞，然后用达拉非尼治疗。miR-26a的过表达显着减少了由达拉非尼治疗诱导的GFP-LC3泪点形成。同时，我们通过Western blot检测裂解的PARP水平来评估黑色素瘤细胞的凋亡水平。在过表达miR-26a的细胞中，裂解的PARP水平显着升高。此外，在过表达miR-26a的细胞中发现HMGB1的蛋白水平相应降低了。综上所述，这些结果表明，miR-26a在黑色素瘤基于达布拉非尼的化学疗法中是自噬的负调节剂，这种作用可能受HMGB1调节。

　　为了进一步了解miR-26a在基于达拉非尼的黑色素瘤化疗中的自噬作用，我们使用shRNA介导的HMGB1缺陷型黑色素瘤细胞进行了一系列研究。相对于表达NTC shRNA的对照，我们观察到HMGB1shRNA表达细胞对达拉非尼的响应导致LC3II水平降低。相应地，也发现达拉非尼治疗诱导的GFP-LC3泪点形成因HMGB1缺乏而减弱。如预期的那样，相对于对照组，达拉非尼治疗在HMGB1缺陷型细胞中诱导的PARP裂解水平显着更高。因此，我们确定HMGB1是miR-26a介导的通过自噬途径介导的药物功效的关键调节剂。

　　根据以上结果，我们希望miR-26a会增强达拉非尼的细胞毒性，而HMGB1具有相反的作用。将转染了miR-NC，miR-26a mimic，NTC shRNA或HMGB1 shRNA的细胞用达拉非尼在100nM下处理24小时。然后，我们通过CCK8测试评估了细胞生存能力，发现与对照组相比，用miR-26a模拟物和HMGB1 shRNA转染的黑素瘤细胞对达拉非尼化疗更敏感。这些结果表明，miR26a可能通过HMGB1致敏达拉非尼诱导的抗肿瘤活性。现在达拉非尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。