ceritinib和曲美替尼trametinib是具有单一药物活性的潜在靶点

　　目前，黑素瘤缺乏BRAF或NRAS突变的异质人群(约35%的病例)缺乏靶向治疗选择。我们进行了一个化学生物学筛选，以确定潜在的新药物靶点的这组未被研究的肿瘤。通过对8株BRAF/NRAS-WT黑色素瘤细胞株对240种靶向药物的筛选，确定了ceritinib和曲美替尼是具有单一药物活性的潜在靶点。Ceritinib增强了曲美替尼对大多数BRAF/NRAS-WT细胞系的疗效，而且在3D球形培养和长期集落形成实验中，联合用药均显示出增加的细胞毒性。　　

　　在BRAF/NRAS-WT黑色素瘤模型中，ceritinib和曲美替尼联合用药可显著抑制肿瘤生长；这并不是由于ceritinib抑制了ALK。机制研究表明ceritinib-trametinib联合使用可增加MAPK和TORC1信号的抑制。当用曲美替尼和TORC1/2抑制剂INK128联合治疗BRAF/NRAS-WT黑色素瘤细胞时，也可以看到类似的结果。　　

　　接下来，我们使用基于质谱的化学蛋白质组学，分别鉴定已知和新的ceritinib靶标，如IGF1R和ACK1。验证研究表明，ceritinib可以通过抑制IGF1R和/或ACK1，以细胞系依赖的方式抑制曲美替尼存在时的mTORC1信号。我们的研究表明，联合一种特异性抑制剂(曲美替尼)和一种更广泛的靶向药物(赛瑞替尼)对具有异质性突变的肿瘤有效。　

　　尽管靶向治疗已被证明对braf突变黑色素瘤有效，免疫治疗在所有基因型(braf突变型和WT)中都显示出了巨大的希望，新的治疗策略仍然迫切需要。作为一个亚组，BRAF/NRAS-WT黑色素瘤的研究很少，迄今为止也没有发现一致的、治疗上易于控制的致癌驱动因素。由于黑色素瘤具有极高的突变负荷，这一分析变得更加复杂；这可能是紫外线辐射暴露在疾病病因学中作用的结果。　　

　　因此，BRAF/NRAS-WT黑色素瘤的转化可能取决于多种基因碰撞的复杂相互作用，共同驱动维持致癌状态所需的通路。目前，免疫疗法如尼鲁单抗和伊匹单抗-尼鲁单抗联合疗法已被常规用于治疗BRAF-WT黑色素瘤。对于检查点抑制剂治疗失败的患者，目前唯一的二线治疗选择是化疗或临床试验。在此背景下，我们试图为BRAF/NRAS-WT黑色素瘤定义新的靶向治疗策略。由于我们的目标是确定具有快速临床转化潜力的药物组合，我们重点关注1)fda批准的或2)目前正在临床开发的药物和靶向抑制剂。　　

　　我们的药物检测发现了多次匹配。鉴定的化合物种类丰富，包括pan-RTK抑制剂(ceritinib、foretinib)、CDK2 (sn -032)、CDK1/2/9 (SCH727965)、GSK3-β (LY2090314)、PLK1 (ON-01910)、NEDD8激活酶(NAE) (MLN-4924)、mTOR (INK128)和MEK (trametinib)。许多这类药物，包括CDK2、CDK1/2/9、GSK3β、NAE、mTOR和MEK抑制剂，已经在体外和体内研究中证明对黑色素瘤细胞系有效。接下来，我们测定了BRAF/NRAS-WT黑色素瘤细胞系对MEK抑制剂曲美替尼的敏感性。　　

　　我们对MEK抑制的关注基于之前的工作，这些工作证明了几乎所有黑色素瘤都依赖于MAPK通路。尽管BRAF/NRAS- wt黑色素瘤缺乏更常见的MAPK驱动因素，如突变的BRAF和NRAS，但它们确实包含其他导致MAPK通路激活的突变。特别是，约13%的BRAF/NRAS-WT黑色素瘤存在RAS-GAP NF1失活突变，另有15-36%的黑色素瘤标本显示NF1表达缺失或减少。NF1功能的缺失通常会导致MAPK信号的增加，这是Ras信号负调控缺失的继发性结果。　

　　在BRAF/NRAS-WT黑色素瘤中，NF1突变经常与其他“ras病”基因的病变同时发生，包括SOS1、RASA2和PTPN1，这往往导致MAPK信号通路的增加。与已发表的研究成果一致，我们的BRAF/NRAS-WT细胞系显示肿瘤抑制因子NF1的反复突变和表达缺失。BRAF/NRAS-WT面板中的所有细胞系都表现出高水平的pERK激活，一些细胞系对曲美替尼单药治疗表现出良好的敏感性。与之前发表的研究一致，NF1状态对MEK抑制剂敏感性的预测并不高。　　

　　单药曲美替尼已在BRAF-WT黑色素瘤患者中进行了评估，发现部分反应。鉴于这一点，以及激酶抑制剂单药治疗通常会导致信号适应和耐药的普遍观察，我们推断曲美替尼将成为BRAF/NRAS-WT黑色素瘤的一个很好的骨干疗法。然后，我们询问筛选出来的候选药物中哪些能成为合适的联合治疗搭档，并根据其与曲美替尼的积极相互作用及其临床可用性确定了ceritinib(36)。　　

　　Ceritinib是一种多rtk抑制剂，fda批准用于治疗EML4-ALK融合阳性非小细胞肺癌(NSCLC)。据我们所知，ceritinib从未对黑色素瘤进行临床前或临床评估。ceritinib和曲美替尼的联合在长期集落形成实验和3D胶原植入球体试验中与细胞毒性增加相关，更接近模拟体内肿瘤微环境。这些反应不仅局限于BRAF/NRAS-WT黑色素瘤，也在我们测试的BRAF和nras -突变黑色素瘤细胞系中观察到。之前的研究表明braf突变黑色素瘤的进展依赖于MAPK和PI3K/AKT/mTOR/S6信号通路。　　

　　在GEM模型中，PTEN的丢失对于BRAF突变黑色素细胞从癌基因诱导的衰老中逃脱以及BRAF突变黑色素瘤的启动都至关重要，这表明了这两种通路在黑色素瘤启动中的作用。我们小组和其他人的研究表明，自适应AKT/mTOR信号是BRAF突变黑色素瘤细胞从BRAF和MEK抑制剂治疗中逃脱的常见事件。这些发现不仅限于braf突变黑色素瘤，也有报道称MEK抑制剂和TORC1/2抑制剂之间的协同作用可用于nras突变黑色素瘤。从机制上看，MAPK和PI3K/AKT/mTOR聚集在关键的细胞生存中心，联合抑制导致凋亡增加。　　

　　我们观察到曲美替尼和赛瑞替尼联合使用增加了对pS6的抑制。Ceritinib作为单一药物对pS6水平影响不大，这表明它在抑制MEK抑制后发生的信号适应中发挥了作用。曲美替尼和mTOR抑制剂INK128组合在3D球形细胞毒性试验中对曲美替尼-ceritinib组合的表型检测能力证明了双MAPK和TORC1信号通路抑制的关键性质。　　

　　我们在这里描述的结果与BRAF突变黑色素瘤和pik3ca突变乳腺癌的研究有相似之处，在这些研究中，TORC1的完全抑制(通过pS6的抑制表明)分别是BRAF和PI3K抑制剂敏感性的生物标志物。在braf突变黑色素瘤中，凋亡诱导需要完全抑制TORC1， PUMA被确定为细胞死亡的关键中介。TORC1抑制作为许多不同靶向治疗反应的生物标记物的重要性反映了pS6作为从多个上游输入信号中读取信号活动的核心作用。因此，最大程度的pS6抑制很可能反映了自适应信号的几乎完全关闭。　　

　　虽然ceritinib-trametinib联合用药对某些细胞系的抑制水平有时仅略高于单一药物trametinib，但这并不是说它不显著。即使是低水平的信号传导也足以在药物治疗后存活。这在接受BRAF抑制剂治疗的黑色素瘤患者中得到了最清楚的证明，在这些患者中，需要抑制>90% pERK才能观察到疗效。　　

　　值得注意的是，ceritinib-trametinib组合除了影响MAPK和TORC1外，还影响了JNK和c-JUN等多个信号通路。众所周知，JNK信号通路是BRAF抑制剂治疗后BRAF突变黑色素瘤细胞适应的关键机制，它驱动RTK信号，限制MEK/ERK抑制的作用。虽然在这里评估的一些BRAF/NRAS-WT细胞系中可能很重要，但在整个细胞系中，反应是不同的，这表明联合用药的复杂性和细胞系的特异性。　　

　　Ceritinib主要是ALK的抑制剂。通过Western Blot检测BRAF/NRAS-WT黑色素瘤细胞系，发现8种细胞中只有一种表达ALK蛋白。在一个表达ALK的细胞系(SK-MEL-23)中，其敲除不影响细胞活力。因此，似乎不太可能ceritinib的作用是通过ALK抑制介导的。接下来，我们使用化学蛋白质组学来确定ceritinib的其他潜在靶点。　

　　ceritinib最受欢迎的药物之一是IGF1R，这是该药物在非小细胞肺癌中的一个已验证的靶点。通过RTK阵列证实了IGF1R作为ceritinib靶点在一些黑色素瘤细胞系中的重要性，没有发现其他RTK被显著抑制。大多数黑色素瘤表达IGF1R，其信号通路与增殖、细胞侵袭和凋亡抵抗有关。在单药治疗中，IGF1R抑制被证明相对较弱；这可能是黑素瘤细胞中高信号冗余的结果。在其他情况下，IGF1R信号通路可能很重要，一些研究表明这种RTK与BRAF抑制剂抗性有关。IGF1R信号在其他肿瘤系统中也被证明是一种重要的自适应信号机制，例如在结肠癌中KRAS被敲除。　　

　　虽然大多数BRAF/NRAS WT黑色素瘤细胞系表达IGF1R，但其siRNA敲除对细胞生长的影响很小，无论是单独使用还是与曲美替尼联合使用。尽管如此，其中一种细胞系WM1963确实对IGF1R敲除表现出敏感性，更重要的是，当IGF1R敲除与曲美替尼trametinib结合时，pS6表现出下降。由于已知黑色素瘤细胞具有遗传复杂性，我们推断多个ceritinib靶点参与了自适应TORC1信号的调节。　　

　　一种候选基因是非受体酪氨酸激酶ACK1/TNK2(活化CDC42相关激酶)，在另外两种BRAF/NRAS-WT细胞系中，当MEK抑制时，ACK1/TNK2的敲除抑制了pS6信号。ACK1是一种中介非受体酪氨酸激酶，连接上游受体激活和下游信号通路。大量的研究已经表明ACK1是一个EGFR相互作用体，EGF刺激导致ACK1和EGFR的关联，导致EGFR降解。ACK1也与许多其他RTKs相互作用，其激酶活性在GAS6、IGF-I和heregulin处理后增加。　　

　　我们的数据共同说明了高特异性药物(如MEK抑制剂)与广泛靶向药物(如赛瑞替尼)联合使用的效用。这种方法的效用在遗传复杂的癌症中得到了证明，在这些癌症中，有效抑制一个关键生长通路并同时抑制多种信号适配的效果可以证明是非常有效的。这种策略在黑素瘤细胞系具有多个同时的逃逸机制(如ACK1、IGF1R)的情况下尤其有利，这些机制聚集在单个信号节点上。我们的研究还说明了将无偏倚药物筛选与化学蛋白质组学相结合来识别fda批准的新型脱靶效应药物的优势，这些药物对缺乏有效靶向治疗方案的癌症有效。详情请扫码咨询：