达克替尼/多泽润在人膀胱癌中的抗肿瘤活性试验情况

　　达克替尼（多泽润）由辉瑞公司提供；西妥昔单抗由Eli Lilly提供；曲妥珠单抗，顺铂和吉西他滨由密歇根大学综合癌症中心药房提供；拉帕替尼购自LC Laboratories。人膀胱癌细胞系自H Barton Grossman获得，所有这些细胞系的表征/鉴定均在实验开始后的6个月内完成，使用短串联重复序列（STR）分析，所有细胞系均在DMEM培养基中保存，并在潮湿的环境中添加10％胎牛血清（FBS）。在37°C下低于5％CO2的条件下。

　　细胞活力和定量

　　使用Soft-Max Pro 5.4软件和SpectraMax M5酶标仪，通过基于蓝色滴度荧光的测定法评估细胞活力。 将亚汇合细胞在2％FBS培养基（100μL）存在的情况下铺板在96孔板中，并使其粘附过夜。第二天，用递增浓度的达克替尼（添加100μL，终浓度为1％FBS培养基）处理细胞。72小时后，将40μL刃天青添加到每个孔中。在另一项实验中，在以下条件下，单剂量2μmol/ L达克替尼或2μmol/ L拉帕替尼或2μmol/ L（或10μmol/ L）西妥昔单抗和/或曲妥珠单抗治疗UM-UC-6细胞。相同的条件。使用GraphPad Prism 5.0分析来自酶标仪的荧光读数。在单独的验证性实验中，为直接定量单次使用达科替尼后72小时的活细胞数量，将细胞用胰蛋白酶消化（TryPLE），用锥虫蓝染色并使用血球计数器计数。

　　蛋白质印迹

　　在10％FBS培养基存在下收集亚汇合浓度的膀胱癌细胞后，评估EGFR，HER2和HER4的基线表达。实验与细胞活力实验同时进行。将亚汇合的UM-UC-3，UM-UC-6和UM-UC-9细胞铺板在2％FBS培养基存在的10-cm孔板上，并使其粘附过夜。第二天，将细胞与达可替尼（0.02–2μmol/ L）孵育5小时，然后收集。在另一个实验中，将亚汇合的UM-UC-6细胞接种在10％FBS培养基存在的10-cm孔板上，并使其粘附过夜。第二天，收集细胞或血清饥饿3小时，此后加入0.2μmol/ L达科替尼或赋形剂。3小时后，加入10 ng / mL EGF，30分钟后收集细胞并用裂解缓冲液处理。将来自每种细胞悬液的相同量的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移到硝酸纤维素膜上。

　　流式细胞仪用于细胞周期分析和凋亡

　　与2μmol/ L达科替尼孵育24、30或44小时后，将细胞以357×g离心5分钟，固定在70％乙醇中，并保存在-20°C下。样品用PBS洗涤，然后溶于含无DNAase的RNAase（100μg/ mL）和碘化丙啶（50μg/ mL）的0.5 mL PBS中，在黑暗中于37°C孵育20分钟。细胞的DNA含量通过配备有ModFit LT程序。与2μmol/ L达可替尼孵育48小时后，根据制造商的说明书使用膜联蛋白V结合测定法评估凋亡程度。然后将收获的细胞悬浮液与膜联蛋白V-APC和7-AAD在膜联蛋白V结合缓冲液（1x）中在黑暗中于室温孵育15分钟，然后通过流式细胞仪进行分析。凋亡也通过胱天蛋白酶3/7裂解发光测定，使用96孔板和读板器。

　　异种移植模型和治疗

　　六个月大的雄性非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD / SCID）小鼠皮下注射（sc）UM-UC-6细胞，并用6 mg / kg达可替尼或溶媒（0.05 N乳酸钠缓冲液，pH 4.0），通过操作系统（PO；“经口”）每天一次管饲，从细胞接种后1天（早期）或1周（后期）开始。此外，向6周龄的雄性NOD / SCID小鼠皮下注射UM-UC-9细胞，并用6 mg / kg的达克替尼或50 mg / kg的拉帕替尼或溶媒处理，每天一次，通过PO灌胃法，在细胞接种后1天（达克替尼早期）或1周开始。此外，在7周龄的NOD / SCID小鼠中建立了UM-UC-6异种移植物。注射后一周，小鼠出现明显的肿瘤，随机分组并用以下药物治疗：吉西他滨和顺铂的第三次剂量为先前剂量的50％。为避免小鼠体重减轻，在UM-UC-9异种移植物中进行了相同的处理，但吉西他滨的剂量为25 mg / kg，顺铂的剂量为1 mg / kg。在所有实验中，每天监测小鼠，每周称重一次，并于4周后安乐死。

　　免疫组织化学和染色评估

　　在微波炉中于pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中进行HER2，Ki67和E-cad抗原修复10分钟，然后冷却10分钟，并用水洗涤10分钟。所有细胞活力实验均一式三份进行，每个实验进行多次。为了关联不同治疗的细胞生存力，进行了包括治疗和时间在内的双向方差分析（ANOVA）。细胞周期分析和凋亡数据与χ进行比较2测试。异种移植治疗组之间的比较通过Mann-Whitney和Kruskal-Wallis非参数测试进行。经过多次比较调整后，用于分析化学疗法治疗的异种移植物。使用GraphPad Prism 5.0进行分析；p<0.05具有统计学意义。现在达克替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。