在患者的书面同意并获得参与医院的伦理委员会的批准后，获得了由University 12 de Octubre医院（西班牙马德里）提供的组织。从这些样品中建立了原代培养物GBM3至7，并按照前述方法进行了处理和培养。由于它们在异种移植物中的生长能力，它们都被证实为神经胶质瘤。所有小鼠实验均已获得ISCIII机构动物护理委员会的批准并根据其指导方针进行，并符合欧盟和国家指令。如先前所述进行异位和原位异种移植。达克替尼（多泽润）是不可逆的苯胺基喹唑啉衍生物，是辉瑞公司提供的一种礼物。其结构已在之前发表。对于体外实验，将其溶于DMSO（20 mmol / L）中并按指示使用。对于小鼠治疗，将达可替尼溶于20 mmol / L乳酸钠（pH 4； 1.5 mg / mL）中。给予小鼠达克替尼（15 mg / kg /天，5天/周）或乳酸钠。
异位异种移植。
对于肿瘤生长曲线测定，当皮下肿瘤明显时开始治疗，并维持3至4周。每周两次用卡尺测量肿瘤。对于短期治疗，在开始给药后5天将肿瘤切除。
原位异种移植。
颅内注射后2至3周，将乳酸或达克替尼给药至小鼠，并维持至处死。
体外测定
根据制造商的说明，通过比色测定法（WST-1试剂； Roche）评估细胞活力。通过2μg/ mL的5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdUrd； Sigma-Aldrich）掺入来确定细胞增殖测定。在这两种情况下，细胞在处理前都要处理3天。对于自我更新测定，将细胞用达comitinib或DMSO处理3天，然后将单细胞以2.5细胞/μL的密度接种在没有药物的新鲜培养基中。6天后计数形成的神经球的数量。
实时定量PCR
使用RNeasy试剂盒（Qiagen）从冷冻的细胞沉淀或冷冻组织切片中提取RNA。用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）和定量实时PCR逆转录总RNA（1μg）。
（qRT-PCR）使用Light Cycler 480（Roche）与SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）进行。HPRT被用作内部表达对照。所用的引物在补充表S2中给出。
蛋白质印迹分析
对于免疫印迹分析，如先前所述收集细胞或小的组织碎片并进行处理。
小鼠磁共振成像
在IP注射Gd-DOTA的小鼠中进行了磁共振成像（MRI）分析。在4.7 TBiospec BMT 47/40光谱仪（Bruker）中以自旋回波序列获取T1W图像。
小鼠组织切片分析
将皮下肿瘤包埋在石蜡中或冷冻保存在30％蔗糖中，并在低温恒温器中切成20μmol/ L切片。对于颅内异种移植，将动物用4％多聚甲醛（PFA; Merck）灌注，然后对大脑进行冷冻保护，并在低温恒温器中切成20μmol/ L的冠状切片。如先前所述进行免疫染色。一抗和二抗显示在补充表S3a和S3b中。
流式细胞仪分析
用抗CD44-FITC（Immunotools）或AC133-PE（Miltenyi）对分解的肿瘤细胞进行染色，并通过流式细胞仪（BD Biosciences）进行分析。
结果
裸鼠的存活率通过Kaplan-Meier方法进行分析，并通过双面对数秩检验进行评估。进行Studentt检验或ANOVA检验以进行体外研究的统计分析。数据表示为平均值±SEM。可证实达克替尼对EGFR扩增的GBM肿瘤细胞具有有效的抑制作用。现在达克替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。
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