奥希替尼AZD9291抑制结直肠癌细胞增殖

　　奥希替尼抑制结直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡　　

　　为确定奥希替尼对CRC细胞的影响，增加奥希替尼浓度作用HCT15和SW48细胞72h，采用MTS法检测细胞的增殖情况。结果显示，奥希替尼有效地抑制了这些细胞系的细胞增殖。接下来，我们研究奥希替尼是否诱导CRC细胞凋亡。在凋亡检测中，我们发现10μg/mL奥希替尼增加了HCT15细胞中Annexinv阳性细胞的数量。我们的研究结果还显示，奥希替尼诱导HCT15细胞中caspases3和7的激活。我们还发现pan-caspase抑制剂z-VAD-fmk预处理后，凋亡反应减弱，表明凋亡反应是caspase依赖的。此外，奥希替尼处理增加了HCT15细胞中caspase3和9的激活。上述数据表明，奥希替尼抑制结直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。　

　　奥希替尼诱导p53无关的PUMA诱导　　

　　接下来，我们研究了奥希替尼诱导CRC细胞凋亡的机制。用10μg/mL奥希替尼处理HCT15细胞，观察诱导作用。奥希替尼处理HCT15细胞后，PUMA蛋白和mRNA水平呈时间依赖性地显著上调。奥希替尼也诱导p53-Knockdown(p53-KD)HCT15细胞中PUMAmRNA的表达。这表明奥希替尼通过p53独立的方式诱导表达。此外，奥希替尼还诱导SW48细胞中PUMA的表达。然而，奥希替尼处理并没有上调其他促凋亡Bcl-2家族成员，包括Bax、Bid和Bim，但降低了抗凋亡蛋白Mcl-1的表达。这些结果表明，不管p53状态如何，PUMA是由奥希替尼选择性诱导的，并可能介导其抗癌作用。　　

　　介导奥希替尼诱导的细胞凋亡　　

　　接下来，我们研究是否PUMA是奥希替尼诱导细胞凋亡所必需的。奥希替尼诱导的凋亡在PUMA稳定敲低(PUMA-kd)HCT15细胞中明显减少。AnnexinV/PI染色证实奥希替尼诱导的PUMA-KDHCT15细胞凋亡减少。此外，我们的研究结果显示，奥希替尼诱导的caspases3/7活化在PUMA-KDHCT15细胞中被阻断。PUMA缺乏也阻断了奥希替尼诱导的线粒体事件，包括caspases3和9的激活和细胞色素C的释放。我们的研究结果表明，PUMA对于奥希替尼在CRC细胞中的抗癌作用是必要的。　　

　　奥希替尼诱导的puma表达需要p73　　

　　接下来，我们分析了奥希替尼诱导CRC细胞PUMA表达的机制。我们研究了几种介导p53非依赖性诱导的转录因子，进一步阐明了诱导的机制。由于奥希替尼处理后未发生改变的磷酸化/激活，FoxO3a没有参与。E2F1和p65由于缺乏诱导作用也被排除在外。我们发现，在HCT15细胞中，奥希替尼以时间和剂量依赖的方式诱导p73的上调。siRNA敲除p73可使奥希替尼在HCT15细胞中诱导PUMA失效。为了确定p73是否可以直接激活PUMA转录，我们发现在ChIP处理奥希替尼后，p73被招募到包含p73结合位点的基因组区域。这些结果表明，p73直接结合到PUMA启动子区域，驱动其转录激活响应奥希替尼处理。　　

　　PI3K/AKT信号通路对于奥希替尼治疗后p73的诱导是必需的　　

　　PI3K/AKT通路促进细胞存活，是EGFR信号通路下游的效应分子。接下来，我们研究了奥希替尼对与PUMA和p73相关的PI3K/AKT信号通路的影响。我们发现，奥希替尼治疗可强烈抑制AKT的磷酸化(Ser473))。在奥希替尼处理后，AKT活性的外源性表达抑制PUMA和p73诱导。这些结果表明PI3K/AKT通路通过奥希替尼介导p73表达。　　

　　PUMA介导奥希替尼（AZD9291）的化学增敏作用　　

　　在临床研究中，奥希替尼已与其他化疗药物联合使用。我们推测，由于奥希替尼和其他药物通过不同途径同时诱导PUMA，PUMA可能介导奥希替尼的化学增敏作用。我们发现，与单药治疗相比，奥希替尼联合5-FU诱导更高水平的PUMA。因此，联合治疗可诱导HCT15细胞凋亡和caspase3活化水平升高。然而，在PUMA-kdHCT15细胞中，联合用药诱导的凋亡和caspase3激活被抑制。这些发现表明，PUMA介导了奥希替尼的化学增敏作用。详情请扫码咨询：