用不同浓度的奥希替尼（泰瑞沙）处理EGFR T790M突变NCI-H1975细胞。治疗24小时后，奥希替尼明显抑制EGFR磷酸化并显着降低PD-L1的蛋白质水平。然后将NCI-H1975细胞与125nmol/L 奥希替尼孵育不同的持续时间。奥希替尼在6h下调了PD-L1的表达。此外，免疫荧光用于在NCI-H1975细胞中定位PD-L1。与未经奥希替尼治疗的组相比，细胞膜在6小时和24小时时显示弱的PD-L1信号。
一致地，用奥希替尼治疗6小时和24小时后，通过流式细胞仪进一步证实了PD-L1在膜上的减少。为了排除由细胞死亡引起的PD-L1 mRNA和蛋白表达的大量抑制，我们进行了MTT分析以检查用奥希替尼治疗后的细胞活力。我们发现，奥希替尼不能在6 h时触发NCI-H1975细胞中的细胞死亡，这在HCC827细胞中得到了进一步验证。此外，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死病抑制剂NSA无法逆转由奥希替尼触发的NCI-H1975细胞中PD-L1的降低。这些发现共同表明，奥希替尼可独立于细胞死亡而降低NCI-H1975细胞中PD-L1的表达。
先前的研究表明，吉非替尼可依赖于EGFR活性的抑制而降低PD-L1 mRNA的表达。为了研究奥希替尼是否可以下调PD-L1mRNA的水平，采用定量实时PCR来检测奥希替尼治疗后PD-L1 mRNA的表达。奥希替尼也导致NCI-H1975细胞中PD-L1 mRNA水平降低超过70％。最近，发现PD-L1是高度糖基化的蛋白，在乳腺癌细胞中具有较长的半衰期。为了确定PD-L1mRNA水平的下调是否会影响其非糖基化形式的表达，使用了衣康霉素来破坏PD-L1的糖基化。用衣霉素处理6小时后，显着部分的未糖基化的PD-L1出现。
奥希替尼明显降低了NCI-H1975细胞中非糖基化PD-L1的表达，表明奥希替尼减少了新PD-L1蛋白的产生，这很可能是因为其mRNA的减少。此外，在另一种EGFR突变型NSCLC细胞系HCC827细胞中，用奥希替尼处理后，mRNA水平和非糖基化PD-L1的表达均被下调。有趣的是，奥希替尼不仅下调了用衣霉素预处理后的非糖基化PD-L1，但也下调了其糖基化形式;因此，我们质疑奥希替尼是否还会引起PD-L1蛋白降解。为了验证该假设，使用了转录抑制剂放线菌素D来阻止RNA的形成。在放线菌素D存在的情况下，具有短半衰期的c-MYC的表达被完全抑制，在奥希替尼治疗NCI-H1975和HCC827细胞6小时后，糖基化的PD-L1减少，表明它发挥了转录后调控的作用。
此外，在用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺进行预处理后，奥希替尼仍降低了PD-L1的表达，表明奥希替尼确实诱导了PD-L1的蛋白降解。此外，我们在NCI-H1975和HCC827细胞系中与或不与奥西替尼共同处理时，进行了环己酰亚胺追赶试验以评估PD-L1蛋白的半衰期。 PD-L1在NCI-H1975和HCC827细胞中的半衰期分别约为17.8 h和13.8 h，而奥希替尼明显将其半衰期分别降至8.6 h和4.6 h。因此，这些结果证实了奥希替尼诱导PD-L1蛋白降解。现在仿制药奥希替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。
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