奥希替尼（AZD9291），罗西替尼，吉非替尼，厄洛替尼，MG-132，硼替佐米，氯喹，Z-VAD-FMK和坏死磺酰胺（NSA）获自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿）。衣霉素，放线菌素D，二甲基亚砜（DMSO），Hoechst 33342，LiCl和3-（-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）获自Sigma）。 细胞系和细胞培养 人EGFR突变的NSCLC细胞系NCI-H1975和HCC827从上海细胞银行获得。
所有细胞系均在补充有10％胎牛血清和抗生素（100μg/ mL链霉素和100单位/ mL青霉素）的RPMI-1640中培养。将所有细胞在含有5％CO2的潮湿培养箱中保持在37°C。 免疫印迹 收获细胞并在含有蛋白酶抑制剂苯基甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解。在冰上孵育20分钟后，将细胞裂解液在4°C下以每分钟15 000转的速度离心20分钟。使用BCA™蛋白测定试剂盒测定上清液中的蛋白质含量。
通过SDS-PAGE分离总共20μg的蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后在室温下用PBST中的5％脱脂牛奶封闭1小时。用针对PD-L1，p-EGFR（Y1068），LC3B，c-MYC，p-GSK3β（S9）和GAPDH在4°C下过夜。所有抗体均购自Cell Signaling Technology。将膜用PBST洗涤20分钟，然后在室温下与抗兔IgG HRP缀合的二抗孵育1小时。使用ECL高级Western印迹检测试剂盒检测信号。
与GAPDH相比，使用Image La软件对PD-L1的相对蛋白水平进行了定量。 免疫荧光 根据制造商的说明进行免疫荧光测定。简而言之，将培养皿中的细胞用PBS洗涤3次，在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟，然后在-20℃的冰冷甲醇中渗透10分钟。 用0.5％BSA封闭1小时后，将细胞与抗PD-L1的一抗在4°C孵育过夜。用PBS冲洗后，将细胞与抗兔IgG（H + L），F（ab'）2片段一起在室温下孵育温度在黑暗中1小时。在室温下用Hoechst 33342染色10分钟后，使用共聚焦激光扫描显微镜对细胞照相。
流式细胞仪分析 通过以每分钟1000转离心5分钟来收集细胞，在37°C下用4％甲醛固定10分钟，然后在室温下与0.5％BSA孵育10分钟。在室温下，将细胞用PD-L1和匹配的同种型对照进行探测1小时。用PBS洗涤3次后，将细胞与抗兔IgG（H + L），F2片段一起在黑暗中孵育30分钟。使用流式细胞仪分析细胞，并使用FlowJo VX进行数据分析。 MTT测定 将细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔板上过夜。然后将细胞用不同浓度的奥西替尼处理6小时。
弃去上清液，将100μLMTT溶液添加到每个孔（1mg/mL）中，然后孵育4小时。通过添加100μLDMSO确定细胞活力，然后在黑暗中摇动10分钟以溶解甲maz。使用SpectraMax M5酶标仪）记录570nm处的吸光度。如果您有需要购买仿制药版本的奥希替尼，可以添加下方微信。蛋白合成抑制剂Cycloheximide用于评估PD-L1的稳定性。细胞在有或没有奥希替尼的情况下共处理0-24小时。在指定的时间提取蛋白质，并进行Western印迹检测PD-L1蛋白的表达。现在仿制药奥希替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。
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