特罗凯/厄洛替尼和miR-34a之间的协同作用

　　针对表皮生长因子受体 (EGFR-TKI) 的酪氨酸激酶抑制剂，例如特罗凯/厄洛替尼，对有限部分的非小细胞肺癌 (NSCLC) 有效。然而，大多数非小细胞肺癌和其他癌症类型仍然具有耐药性。以内源性肿瘤抑制基因 miRNA 为模型的治疗性 miRNA 模拟物通过同时抑制多个癌基因来抑制肿瘤生长，因此可用于增加药物敏感性。在这里，我们研究了 miR-34a 和厄洛替尼的关系，并确定了该组合在具有原发性和获得性厄洛替尼耐药性的 NSCLC 细胞中的治疗活性。该药物组合还在一组肝细胞癌细胞 (HCC) 中进行了测试，这是一种已知对厄洛替尼难治的癌症类型。使用多种分析方法，确定了药物诱导的癌细胞增殖抑制以揭示加性、拮抗或协同作用。我们的数据显示，在所有测试的癌细胞中，厄洛替尼和 miR-34a 模拟物之间存在强烈的协同相互作用。在一系列不同的剂量水平和药物比例中观察到协同作用，降低了 IC厄洛替尼和 miR-34a 的50 个剂量要求分别增加了 46 倍和 13 倍。在提供高水平癌细胞抑制的剂量下检测到最大协同作用，超出了单独由单一药剂诱导的水平，因此具有临床相关性。数据表明，当与基于 miR-34a 的疗法联合使用时，大多数 NSCLC 和其他以前不适合厄洛替尼的癌症可能证明对该药物敏感。

　　特罗凯/厄洛替尼和 miR-34a 在肝细胞癌细胞中协同作用

　　为了研究特罗凯/厄洛替尼和 miR-34a 的协同活性是否适用于其他癌症适应症，我们在肝细胞癌的细胞模型中探讨了这种组合。选择肝癌作为测试平台是因为厄洛替尼作为单药对晚期肝病患者具有中等疗效，但与索拉非尼联用未能延长总生存期和进展时间。此外，目前正在临床试验中的 miR-34a 脂质体 MRX34 在临床前动物研究中有效消除了肝脏肿瘤，因此与厄洛替尼联合使用可能是一种有吸引力的药物。使用的细胞模型包括 Hep3B、C3A、HepG2 和 Huh7，其中几个显示厄洛替尼抗性基因AXL的上调，HGF、FGFR1和ERBB3与厄洛替尼敏感的肺癌线相比。总的来说，肝癌细胞中 miR-34 家族成员的水平很低或检测不到。与我们的预期一致，在这四种细胞系中，厄洛替尼的IC50值为 25 μM 或更高。miR-34a的 IC50值介于 0.3 和 2.3 nM 之间，因此与肺癌细胞中的值相似。这些值被用作指导以固定比例的 IC50:IC50组合厄洛替尼和 miR-34a，并产生 CI、等值线和 IC50eq 值。此外，还在不同浓度的矩阵中测试了每种组合，以评估跨多个比率的组合效应。我们的数据预测在所有测试的细胞系中厄洛替尼和 miR-34a 之间有很强的协同作用。在高水平的癌细胞抑制下观察到协同作用，因此发生在所需的活性范围内。该结果由 IC50eq 曲线位移分析证实，表明在更高剂量和效应水平下的协同作用。分析还表明，与单一药物相比，联合用药的最大抑制活性显着增强。等效线图表明，当与 miR-34a 一起使用时，厄洛替尼剂量显着减少，以诱导 50% 或更高的抑制，例如 80%。联合使用时，厄洛替尼可以低至 2 μM 的浓度使用，以抑制 50% 的癌细胞，从而与单次使用相比，将其剂量降低 75 倍（参见 HepG2）。协同作用不限于特定的比率，但在大多数测试的比率中都很明显。因此，这些数据与在肺癌细胞中产生的数据相似，并预测厄洛替尼-miR-34a 组合在单独厄洛替尼不足的癌症中的疗效增强。

　　药物间相互作用的准确评估是复杂的，因为结果取决于药物比例、药物浓度和所需的效力。为了研究 miR-34a 模拟物和厄洛替尼之间的药理学关系，我们使用了多种分析方法来揭示药物增强（“固定浓度”模型）并区分可加性、拮抗作用和协同作用（“固定比率”模型）。我们检查了 CI 值、等效线图和 IC50来自线性或非线性数据回归的等价物。我们的数据显示 miR-34a 增加了所有测试癌细胞对厄洛替尼的敏感性——无论它们是否与原发性或继发性/获得性耐药相关。肿瘤抑制基因 miRNA 抑制多种癌症通路这一事实提供了一个合理的解释。为了支持这一假设，与厄洛替尼耐药性相关的基因产物AXL和MET被 miR-34a 直接抑制。出乎意料的是，特罗凯/厄洛替尼还增强了 miR-34a 模拟物的治疗效果，尽管现有证据表明 miR-34a 控制多种致癌信号通路，包括 EGFR 通路。因此，该结果表明 miRNA 模拟物可以与单一基因导向疗法协同作用，并邀请寻找其他组合。根据我们的数据，我们推测 miR-34a 还可能与其他 EGFR 抑制剂（如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗和西妥昔单抗）以及 HER2 抑制剂（如拉帕替尼、帕妥珠单抗和曲妥珠单抗）协同作用。

　　在获得性耐药的肺癌细胞 (HCC827res) 中，添加少量 miR-34a 能够将特罗凯/厄洛替尼的 IC50值降低到 0.1 μM 以下。这是一个显着的结果，表明与亲代 HCC827 细胞相比，miR-34a 可以使该细胞系对厄洛替尼同样敏感。在具有原发性耐药的肺癌细胞中，厄洛替尼的 IC50剂量要求降低了 4 到 46 倍，约为 2 μM。这可能在具有临床效用的浓度范围内。厄洛替尼以每日口服剂量最高 150 毫克的形式给药。尽管 MRX34 的临床剂量水平尚未确定，但临床中使用的 miR-34a 和厄洛替尼之间的摩尔比很可能在我们的细胞研究中显示出协同作用的比例范围内。需要进一步研究以确认该组合在体内的优越活性，这将考虑每种药物特有的给药途径、吸收和药代动力学特性。

　　特罗凯/厄洛替尼目前被用作具有激活EGFR突变的NSCLC 患者的一线治疗。它还用作化疗后的维持治疗以及至少一种先前化疗方案失败的局部晚期或转移性非小细胞肺癌的二线和三线治疗。临床试验未能证明厄洛替尼联合顺铂/吉西他滨或卡铂/紫杉醇与单独常规化疗相比具有生存益处。最近一项研究厄洛替尼加索拉非尼治疗 HCC 的 III 期试验也未达到其终点。因此，需要用于联合治疗的其他方法。我们的数据显示，特罗凯/厄洛替尼加 miR-34a 的组合特别有效，可能会大大扩大可以用厄洛替尼治疗的 NSCLC 患者群体。这种组合在 HCC 细胞中具有类似的协同作用，表明这种协同作用可能是其分子作用机制的结果，也可应用于非小细胞肺癌以外的癌症。由于 MRX34（一种装载有合成 miR-34a 模拟物的脂质体纳米颗粒）最近进行了 1 期临床试验，可以快速启动厄洛替尼-miR-34a 组合的临床测试。

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