已知 EGFRvIII 可增加癌细胞的增殖、存活和调节治疗反应。我们通过蛋白质印迹分析验证了 EGFR、EGFRvIII 和 EGFRvIII DK 在 U87MG 和 U251 细胞中的表达。并通过MTT法分析增殖率。与之前的报告一致,我们观察到与亲本 U87MG、EGFR 和 EGFRvIII DK 过表达细胞相比,U87EGFRvIII 细胞的增殖显着增加(p < 0.0001)。为了分析 TMZ 和阿法替尼(afatinib)对 GBM 的细胞毒性作用,U87MG 和 U87EGFRvIII 细胞用不同浓度的 TMZ(10-500 μM)或阿法替尼(0.25-5.0 μM)处理 48-72 小时,并通过 MTT 分析进行分析。在 TMZ 和阿法替尼治疗后观察到 GBM 细胞活力的剂量依赖性降低。25% (IC25) 值的抑制浓度对于 TMZ 约为 25 μM 和 300 μM,对于 U87MG 和 U87EGFRvIII 细胞,阿法替尼的抑制浓度分别为2 μM 和 1 μM。最近,对 35 名 GBM 患者的药代动力学分析表明,大约 10-25 μM 浓度的 TMZ 到达脑脊液 (CSF)因此为了模拟体内条件,我们在所有体外实验中使用了 25 μM TMZ 和 1 μM 阿法替尼。因此,我们的 CI 图揭示了在 U87EGFRvIII 细胞中将阿法替尼与 TMZ 组合后,细胞活力的额外且接近协同的降低。
集落形成试验显示,与载体处理的对照细胞相比,阿法替尼和TMZ均显着降低了 GBM 细胞 U87MG、U87EGFR WT、U87EGFRvIII 和 U87EGFRvIII DK 的克隆形成。在U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 细胞中,TMZ 比阿法替尼更能抑制集落形成,而 U87EGFRvIII 细胞具有相对抗性。然而,阿法替尼与 TMZ 的组合消除了U87EGFRvIII 细胞的集落形成能力。与载体处理的对照相比,TMZ (p= 0.01)、阿法替尼 (p= 0.03) 和 TMZ 加阿法替尼 (p= 0.01)的 U87MG 细胞集落形成的百分比减少为 96.3 ±0.3、58±6.2、98.4± 0.7,分别。
与对照组相比,TMZ、阿法替尼和联合组的 U87 EGFR WT 集落形成减少的百分比分别为 66.5 ± 1.8、41.4 ± 1.9 和 80.5 ± 1.2(p= 0.001),分别。U87EGFRvIII 形成的集落比 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 细胞更大。类似地,与对照组相比,TMZ、阿法替尼和联合治疗组由 U87EGFRvIII 形成的集落的平均减少百分比分别为 89.6 ± 3.0、56.6 ± 7.0 和 94.5 ± 0.6。此外,与单独使用 TMZ (p= 0.048) 或阿法替尼 (p= 0.005)相比,阿法替尼加 TMZ 显着减少了 EGFRvIII 集落。与对照组相比,TMZ (p= 0.02)、阿法替尼 (p = 0.02) 和联合组 (p = 0.01)的 U87EGFRvIII DK 集落形成的百分比分别为 85.0 ± 2.3、78.3 ± 1.5 和 95.3 ± 0.3。总体而言,与单独使用 TMZ 相比,联合治疗显着降低了 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII 集落生长(p= 0.01)。对于 U251 和 U251EGFRvIII GBM 细胞观察到类似的结果(数据未显示)。
我们分析了阿法替尼是否可以阻断 U87EGFRvIII 细胞的不依赖贴壁生长的细胞,因为 EGFRvIII 在癌细胞增殖中起着重要作用,并且不依赖贴壁的生长可预测体内致瘤性。TMZ 显着降低了 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 中的集落大小和集落数量,而 TMZ 对 EGFRvIII 细胞的影响较小。TMZ 单独或与阿法替尼组合也显着减少了 U87MG 小菌落 (p= 0.03) 和大菌落 (p= 0.02) 的数量。
TMZ 和阿法替尼单独显着减少 U87EGFR WT 大集落的数量(p= 0.05) 而 TMZ 和阿法替尼组合显着减少小菌落 (p=0.03) 和大菌落 (p = 0.03) 的数量。阿法替尼或联合治疗显着减少了 U87EGFRvIII 小[(阿法替尼(p = 0.02);联合(p = 0.01)]和大集落(阿法替尼(p = 0.02);联合(p = 0.01))的数量。TMZ或阿法替尼或联合治疗显着减少了 U87EGFRvIII DK 小菌落数 (p= 0.03),而 TMZ 和联合治疗显着减少了大菌落 [TMZ (p= 0.048); 联合 (p= 0.038)]。总体而言,联合无论 EGFR 的激活状态如何,阿法替尼治疗都完全消除了 GBM 细胞的锚定非依赖性生长。现在阿法替尼的价格是多少?更多详情可咨询下方微信。
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