乐伐替尼/仑伐替尼与抗PD-1/PD-L1免疫疗法的结合

　　由于几乎不可避免地出现了对当前多模式疗法的耐药性，并且难以招募患者参加临床试验，因此ATC的稀缺性和侵略性提出了独特的挑战。因此，临床前动物模型是加速新药从台到床筛选和优先排序及其最有效组合和顺序的宝贵工具。 乐伐替尼（仑伐替尼）与抗PD-1/PD-L1免疫疗法的结合特别令人感兴趣，因为两者均已在临床上获得，并且上述观察结果表明，可能将它们联合使用以产生协同作用。尽管临床前数据有限，但这种基本原理已引起足够的兴趣来支持最近启动的将其用于转移性和复发性DTC（NCT02973997）的II期临床试验。

　　在我们的研究中，我们假设将乐伐替尼与抗PD-1/PD-L1疗法联合使用可在原位ATC免疫小鼠模型中产生优异的抗肿瘤反应并改善生存率，而生存率的提高与增强的生存能力相关。通过转录和免疫分析来测量免疫应答。 在这项研究中使用了一种鼠类甲状腺癌细胞系TBP-3743。并在补充了10％胎牛的Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM）中培养血清和青霉素和链霉素。随后，这些细胞用于原位注射或铺板于70-80％融合度，并用10μMlenvatinib处理24小时。

　　抗PD‐L1（10F.9G2）和抗PD‐1抗体先前已经过鉴定20 -Ly6C-PerCP/cy5.5抗体购自eBioscience。抗Ly6G-PE，抗CD206-PE，抗IA / IE-PerCP / cy5.5，抗CD274-PerCP /cy5.5，抗NK1.1-PE / cy7，抗CD11b-APC/cy7和抗CD3 / CD28抗体购自BioLegend。 LEAF™纯化的抗小鼠Gr-1抗体是从BioLegend购买的，用于MDSC消耗。

　　使用Trizol方法分离RNA，并使用Superscript VILO cDNA合成试剂盒合成cDNA。如前所述，使用TaqMan基因表达测定法通过实时逆转录酶聚合酶链反应（qRT-PCR）测量PD‐L1基因的表达.将基因表达水平标准化为GAPDH表达，并使用比较循环阈值（Ct）方法。在广州华音医学检验中心使用HiSeq 2000对分离的RNA进行配对末端RNA测序。测序数据被检索为FASTQ文件，并进行了质量控制分析，以确保碱基鉴定的高质量。使用GRCm38小鼠基因组使用kallisto进行无比对定量，进行RNA定量。量化的转录本折叠为基因计数，用于差异表达分析。

　　从进一步的分析中过滤掉所有预测基因和假基因。使用edgeR进行差异表达分析。为了进行基因集富集分析（GSEA），首先将先前鉴定的小鼠基因定位到直系同源人类基因上。匹配的直系同源物通过在成对的治疗条件之间下降log2倍下降来排序，然后使用GSEA Desktop将得到的排名列表用作GSEA的输入。GSEADesktop在markes基因上运行分子特征数据库的集合。所有动物实验均根据联邦，地方和机构指南在马萨诸塞州综合医院进行，所有实验方案均已获得我们机构动物护理和使用委员会的批准。

　　简要地麻醉36只六周大的B6129SF1/J雌性小鼠，暴露甲状腺，并使用27号针头注射105种经基因工程改造的TBP-3743鼠肿瘤细胞， 在植入后第7天，将小鼠随机分组：对照小鼠接受了对照饮食，乐伐替尼组接受了30mg/kg的0.5％甲基纤维素悬浮液通过口服管饲法，抗PD-1和抗PD-1组接受对照饮食，并以200μg/小鼠的IP注射抗PD-1或抗PD-1抗体每隔一天，联合治疗组同时接受乐伐替尼和抗PD-L1或抗PD-1抗体。当对照小鼠达到人道终点时，在植入肿瘤后2周对小鼠实施安乐死。

　　重复两次实验（总n=108），并显示了代表性的结果。使用相同的方法进行了生存分析（n=40小鼠），但是利用了人道的终点（每天监测体重减轻> 20％，皮肤衰弱，呼吸窘迫或身体状况评分差，修饰或活动性不足）。通过将以下治疗组添加到上述实验中来进行MDSC耗竭实验（n=22）：200μg/小鼠抗Gr-1抗体（n = 6）I.P.每隔一天总共服用四剂，并同时服用乐伐替尼和anti-Gr-1（n = 6）。肿瘤植入后2周对小鼠实施安乐死；消耗实验重复一次。如果您有需要购买仿制药乐伐替尼？更多详情可咨询下方微信。