Ponatinib帕纳替尼诱发血栓形成的机制

　　ponatinib如何诱发血栓形成的机制尚未完全了解。Loren及其同事在2015年研究了普纳替尼可能的促血栓形成作用。与未经处理的样本相比，在体外向洗涤的血小板中加入0.1至1μM的普纳替尼可抑制GPVI激活途径。此外，与用Src家族激酶抑制剂PP2处理的血小板相似，普纳替尼处理的血小板在纤维蛋白原或胶原表面上的扩散较少，但与1μM尼罗替尼或伊马替尼处理的样品相反。其次，连接到纤维蛋白原或胶原蛋白的普纳替尼处理的血小板减少了磷酸化的GPVI通路激酶，例如LynY507、SrcY416、LatY191或BtkY223类似于PP2处理的血小板，但不是尼罗替尼或伊马替尼处理的样本。第三，浓度低至0.1μM的普纳替尼可显着降低对胶原相关肽(CRP)(3μg/mL)刺激作出反应的血小板聚集，该浓度接近在患者中观察到的最大血浆浓度。与具有100%聚集和14.3±3.1秒滞后时间的载体处理的血小板(1%DMSO)相比，这些血小板具有4.3±20.5%的聚集和42.0±5.1秒的滞后时间(p<0.05)。在这些研究中，ponatinib治疗显着降低了聚集百分比，并增加了血小板形状变化和聚集响应CRP刺激的滞后时间。最后，通过流式细胞术检测，ponatinib治疗还降低了血小板P-选择素和磷脂酰丝氨酸的暴露，以响应胶原相关肽（CRP=10μg/mL，n=3，p<0.05）。这些联合研究表明，整合素α2bβ3和GPVI通路在ponatinib处理的（0.1至1.0μM）血小板中受到抑制。　

　　Hamadi及其同事还研究了ponatinib的离体和体内使用。在胶原表面的离体流动模型中使用0.1和1μM波纳替尼，波纳替尼治疗促进了血栓生长。此外，他们表明，通过对8周龄C57BL/6小鼠口服3mg/kgponatinib，经ponatinib治疗的小鼠在氯化铁测定中具有促血栓形成，同时显着缩短了闭塞时间和更大的血栓体积。他们还在ponatinib治疗后4小时检测到炎症细胞因子TNFα和IL6增加。此外，他们观察到在给予ponatinib前24小时使用钙通道阻滞剂地尔硫卓可降低该TKI的促血栓形成作用。　　

　　根据PACE试验的结果，我们独立检查了ponatinib的促血栓形成作用。当这些调查开始时，我们知道Loren等人。研究，我们选择创建一个体内模型，模拟ponatinib使用的稳态，野生型C57小鼠的血浆浓度与人类相似。我们用3mg/kg每天两次口服普纳替尼治疗18-20周龄小鼠（CML患者的中位年龄为60岁），持续14天。在开始治疗后第4、2和24小时，通过LC/MS/MS测定获得3mg/kg/po两次的ponatinib药物水平。它们分别为176±47和11.4±3.4ng/mL，分别转化为33至2nM的最大最终体内浓度。这些浓度类似于通过口服给药在人体中达到的浓度。初步研究表明，与载体（柠檬酸盐缓冲液）处理的小鼠相比，以这种方式给药的小鼠在用Rose-Bengal诱导血栓形成后发生颈动脉闭塞的时间明显更短（10.4±2.9分钟对32.3±4.8分钟，p<0.0001)。在8-10周龄的C57BL/6小鼠中，我们没有看到类似普纳替尼治疗的颈动脉血栓形成时间同样缩短。一旦确定ponatinib治疗的小鼠缩短了诱发闭塞时间，我们就开始了一项调查，以确定促血栓形成状态是否是由于鼠凝血蛋白、血管壁或血小板（决定平衡的三个关键成分）的变化引起的止血和血栓形成之间。　　

　　普纳替尼处理的动物具有正常的凝血酶原(PT)和活化部分凝血活酶(aPTT)时间，并且与媒介物处理的小鼠血浆没有区别。此外，在普纳替尼治疗后，接触激活和组织因子介导的凝血酶生成时间(TGT)显示普纳替尼治疗和载体治疗的小鼠血浆之间没有统计学差异。这些数据表明血液凝固蛋白在ponatinib治疗的小鼠中没有异常。此外，普纳替尼治疗的小鼠具有正常的全血细胞计数，包括血小板计数和正常的白细胞分类细胞计数[。　　

　　由于ponatinib独特地抑制了许多影响血管壁的信号系统（FGFR、VEGFR、PDGFR和Tie2）和抑制内皮中Abl1激酶的负面影响，研究检查了ponatinib的稳态水平是否影响血管壁生物学。调查确定了来自ponatinib治疗的小鼠的主动脉是否显示出细胞凋亡和活性氧增加的证据。血管壁细胞凋亡与血栓形成有关。在小鼠组织研究中，我们发现包括脂肪组织在内的血管外膜中caspase3的表达显着增加。我们还使用普纳替尼处理的血管壁中的硝基酪氨酸抗体鉴定了增加的活性氧(ROS)。外膜的查找容器凋亡与增加的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶衍生的ROS。　　

　　其他调查检查了ponatinib是否影响血小板功能，以确定它们是否也有助于观察到的患者动脉血栓形成事件。尾部出血时间显示，普纳替尼治疗的小鼠为55±12秒（平均值±SEM），该值比未治疗小鼠的102±9.3秒短，每组p<0.033，n>20。我们接下来检查了在α-凝血酶刺激后胶原相关肽（CRP）和蛋白酶激活受体后血小板GPVI的激活。体内ponatinib治疗引发血小板，使得它们的CRP或α-凝血酶-诱导JON/A（鼠血小板上α2bβ3整合素复合物的活化异二聚体复合物的表位）的表达（p<0.01)和P-选择素(CD62)(p<0.01)在流式细胞术中检测时显着高于未处理的血小板。这些研究表明，ponatinib的体内给药会改变血小板，使其在较低浓度的CRP和α-凝血酶下被激活。用ponatinib体内处理血小板的这些实验与Loren等人的体外研究之间的差异。是在体内实验中TKI的最终浓度介于2-33nM之间，而在体外研究中则为100-1000nM。由于Lyn具有组成型活性，体内研究中的较低剂量可能通过仅阻断p-LynY507处的较高抑制位点而产生了p-Lyn的开放构象。这些联合研究表明，ponatinib治疗会改变血管壁和血小板功能，使后者过度活跃。　　

　　接下来，我们寻找了一种解毒剂来对抗ponatinib对血管壁和血小板的影响。初步研究表明，在ponatinib治疗的小鼠中，主动脉Sirt1、KLF4、血栓调节蛋白和内皮细胞一氧化氮合成酶降低。我们假设刺激Sirt1的PPAR-gamma激动剂，即吡格列酮，可能会纠正这些缺陷。当ponatinib治疗的小鼠也给予吡格列酮（10毫克/公斤/天，口服）时，与单独使用帕纳替尼ponatinib治疗相比，血栓形成时间显着延长并纠正为正常（41±3.7分钟，p<0.025）（p=0.0009）。此外，吡格列酮治疗与波纳替尼联合治疗使CRP的阈值浓度正常化（即增加），以诱导血小板上的血小板JONA和P-选择素(CD62)表达。这些实验表明，在我们的小鼠模型中，吡格列酮是普纳替尼的解毒剂。在几项随机临床试验中，吡格列酮被认为对心血管事件具有保护作用。此外，由于吡格列酮是一种Stat5抑制剂，已表明它还可以增加CML的分子缓解。我们在实验中观察到Stat5抑制。详情请扫码咨询：