预测达拉非尼和达拉非尼组合的敏感性

　　大约一半 BRAF 突变的非小细胞肺癌 (NSCLC) 具有非 V600 BRAF 突变，全世界每年约有 40,000 人死亡。最近的研究揭示了联合靶向治疗与 RAF 抑制剂（达拉非尼）和 MEK 抑制剂（曲美替尼）在治疗 V600 BRAF 突变癌症（包括 NSCLC）方面的益处。相比之下，没有记录非 V600 BRAF 突变对这些抑制剂的敏感性。非 V600 突变可以增加或削弱 BRAF 激酶活性。然而，受损的 BRAF 激酶仍然可以以 CRAF 依赖性方式激活 ERK 通路。在此，除了描述 BRAF 突变 NSCLC 患者队列和功能分析 13 种肿瘤衍生的 BRAF 突变之外，我们证明，在 HEK293T 细胞、肺上皮细胞模型 (BEAS-2B) 和具有非 V600 BRAF 突变的人类癌细胞系中，两种类型的非 V600 BRAF 突变都可能对临床相关剂量的达拉非尼和曲美替尼敏感。通过组合药物治疗，这两种类型的突变诱导的 ERK 活性进一步降低。此外，该组合导致更长时间的 ERK 抑制，并在含有两种类型的非 V600 BRAF 突变的细胞中具有抗增殖和促凋亡作用。本研究为使用曲美替尼和达拉非尼治疗非 V600 BRAF 突变肺癌的临床探索提供了基础。通过组合药物治疗，这两种类型的突变诱导的 ERK 活性进一步降低。

　　在这项研究中，我们对聚集在 BRAF 基因外显子 11 和 15 中的一组 NSCLC 衍生突变进行了功能分析。这些突变是在我们机构诊断和治疗的一组患者的常规诊断筛查过程中发现的（七个突变），或者之前在文献中报道过（六个突变）。在我们机构发现的 7 个突变是在一组预先选择为有限或非吸烟史的 NSCLC 患者中确定的。总队列中的 229 名 NSCLC 患者中有 12 名 (5.2%) 具有 BRAF 突变。，据我们所知，我们的 BRAF 突变 NSCLC 患者队列表现出非 V600 BRAF 突变在 NSCLC 中报告的最高频率。这些 BRAF 突变的 NSCLC 没有伴随 KRAS、NRAS、EGFR、ERBB2 或 ALK 突变。

　　在 HEK293T 细胞中，临床相关剂量的达拉非尼（一种 I 型 RAF 抑制剂）降低了由 BRAF 突变诱导的 ERK 活性，在存在和不存在 CRAF 的情况下赋予高激酶活性。此外，达拉非尼还抑制由 BRAF 突变体诱导的 ERK 活性，这些突变体赋予与 CRAF 共表达的激酶活性受损。唯一的例外再次是 D594V BRAF/CRAF 共转染子，它在 Dabrafenib 处理后显示出增加的 ERK 活性（类似于 wt-BRAF/CRAF）。当 RAF 处于非活性状态时，RAF 抑制剂可以诱导抑制剂结合的 RAF 与无抑制剂的 RAF 发生二聚化，导致其反式激活和过度激活，最终导致 ERK 通路激活。正如我们所观察到的，即使在 CRAF 存在下，D594V BRAF 也不会诱导强烈的 ERK 活性。该结果表明 RAF 同种型在 D594V BRAF 存在下保持无活性。因此，达拉非尼治疗后的通路激活可以通过达拉非尼对 RAF 亚型的非活性部分的相反作用模式来解释。

　　在三种测试细胞系中，与单一疗法相比，达拉非尼和曲美替尼的组合导致增强的生长抑制。

　　在所有测试的细胞系中，与单药治疗（48 小时）相比，联合治疗增强并延长了 ERK 抑制。与在 V600 突变细胞中一样，该结果表明联合 RAF 和 MEK 靶向可以克服非 V600 BRAF 突变细胞中对 RAF 抑制剂单药治疗的早期适应性不敏感性。

　　有趣的是，H1666 和 H508 细胞系以前被证明对选择性 RAF 抑制剂 Vemurafenib 以及 MEK 抑制剂 Selumetinib 具有抗性或反应性较差。由于给定细胞系中的 ERK 激活是 CRAF 介导的，Vemurafenib 是一种弱 CRAF 抑制剂这一事实可能会导致不同的反应。值得注意的是，CRAF 敲低已被证明可抑制 H1666 细胞的生长。

　　总之，我们的研究结果证实非 V600 BRAF 突变在 NSCLC 中并不罕见。我们证明非 V600 BRAF 突变会导致激酶活性升高或受损，从而对达拉非尼和曲美替尼联合治疗产生敏感性。达拉非尼单药治疗效果微弱，单独使用达拉非尼靶向受损激酶 BRAF 突变或 CRAF 过表达细胞甚至可能导致矛盾的 ERK 激活。值得注意的是，之前没有描述过具有激酶活性受损的突变细胞对联合达拉非尼和曲美替尼治疗的敏感性。我们的研究结果支持对达拉非尼-曲美替尼联合治疗在肿瘤中含有非 V600 BRAF 突变的晚期 NSCLC 患者的疗效的临床探索。

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