乐伐替尼/仑伐替尼是否直接影响PD‐L1表达

　　为了评估乐伐替尼是否直接影响PD‐L1表达，我们使用乐伐替尼处理了TBP‐3743（我们原位小鼠模型中使用的鼠ATC，并通过流式细胞术测量了PD‐L1。没有观察到PD-L1表面表达的变化。一组经过乐伐替尼（仑伐替尼）治疗的人类ATC细胞系中均证实了这种作用的缺乏，而且甲状腺细胞特异性基因的表达没有变化，并且观察到先前报道的pERK变化。通过MTS增殖测定法确定的乐伐替尼对TBP-3374的IC50为21.3μM。考虑到乐伐替尼对肿瘤细胞及其微环境均具有复杂的作用，我们对TBP-3743（原位小鼠模型中使用的鼠类ATC进行了双末端RNA测序（RNA-Seq）。

　　安乐死后立即通过心脏穿刺术获得小鼠全血，并将其收集到同一组的多只小鼠中，以提供足够的样品。 在麻省总医院的机构审查委员会批准后，我们高级甲状腺癌诊所的一名ATC患者通过NIH临床试验NCT02657369接受了乐伐替尼。在每个时间点使用肝素钠管静脉穿刺获得10–20 mL外周全血。

　　对于人类和鼠类样品，均按照制造商的说明，通过进行梯度密度离心，分离外周血白细胞（PBL），该方法优先分离单核细胞和淋巴细胞并沉淀中性粒细胞和红细胞。 用福尔马林固定小鼠肿瘤以进行免疫组化（IHC）。切成4μm的切片并用苏木精和曙红染色，或对CD8，，F4/80或FoxP3进行IHC染色。阳性细胞显示为每个高倍视野中有核细胞总数的百分比。解剖新鲜肿瘤以去除软组织，并在37°C下用HBSS中的胶原酶（100u/mL）和分散酶（0.5mg/mL）消化30–45分钟。

　　使肿瘤块通过70μM过滤器以产生细胞悬液。将细胞在PBS中洗涤，并在4°C的离心机中以1300 rpm离心8分钟，在冰上用2％多聚甲醛固定10分钟，然后再次洗涤。 小鼠肿瘤细胞和PBLs与Trustain fcX™一起预孵育。样品用一抗染色30分钟，洗涤两次，然后转移到标准流式细胞仪缓冲液中。使用BD FACSVerse™流式细胞仪分析细胞。

　　免疫细胞群始终位于总有核细胞上，并以总细胞的比例显示。 从一只雌性B6129SF1 / J小鼠中收获脾脏，将其机械破碎并过滤以获得脾细胞悬液。使用EasySep小鼠CD8+T细胞分离试剂盒分离T细胞，并根据制造商的说明书在室温下用微摩尔CFSE标记2分钟。然后将T细胞悬浮在RPMI 1640培养基中，该培养基中添加了10％FCS，1.5％HEPES，1％谷氨酰胺，1％非必需氨基酸，1％丙酮酸钠，1％Pen / Strep，0.1％庆大霉素， 50μMβ巯基乙醇。

　　孔板在4°C下涂有抗CD3 / CD28抗体过夜，然后根据制造商的说明用于T细胞刺激。 MDSCs是在37°C下用HBSS中的胶原酶（100单位/mL）和分散酶（0.5mg/mL）消化后从鼠类肿瘤中获得的。通过70μm的过滤器过滤细胞悬液，并用HBSS洗涤。在FACS缓冲液中的冰上用抗CD11b，抗Ly6C / Ly6G染色细胞30分钟，然后使用FACS分选。将MDSC加入到96孔板中的105个初免T细胞中，技术重复，MDSC：T细胞比率为2：1、1：1、1：5和1:10，并在其中孵育5天。 37°C 5％CO2培养箱。然后收集细胞，用抗CD3抗体（Biolegend）染色，并使用流式细胞仪分析CD3+CFSE染色的细胞。

　　与对照组相比，经过乐伐替尼处理的细胞中共有218个基因显着差异表达；最重要的基因显示在图1b和支持信息图S1中。使用qRT-PCR验证了具有显着变化的基因子集。有趣的是，许多受影响最大的基因包括Cd28，Lilrb4a，Anxa8，Map2k7和Pde2a，都参与了免疫途径或免疫途径的下游。进行GSEA的目的是突出按其生物学功能组织的基因集。除了预期的血管生成和缺氧基因组显着下调外，还存在与上皮间质转化，细胞凋亡以及涉及炎症和免疫反应的多种途径相关的组的下调。 -2 / STAT5，IL-6 / JAK-STAT3）。如果您有需要购买仿制药乐伐替尼？更多详情可咨询下方微信。