泰菲乐/达拉非尼是一种特异性高效的BRAF抑制剂

　　丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活与多种类型的人类癌症有关。在黑色素瘤、大肠癌、卵巢癌、甲状腺乳头状癌和胆管癌中，构成性激活MAPK信号通路并绕过上游刺激需求的BRAF突变发生率很高。在这份报告中，我们描述了新型、有效、选择性BRAF抑制剂达拉非尼 (泰菲乐)。达拉非尼 (泰菲乐)抑制BRAFV600E激酶活性，导致MEK和ERK磷酸化降低，并通过最初的G1细胞周期阻滞抑制细胞增殖，随后细胞死亡。在一个含brafv600e的人类黑色素瘤异种移植模型中，口服达拉非尼抑制ERK激活，下调Ki67，上调p27，导致肿瘤生长抑制。然而，据报道，对于其他BRAF抑制剂，达拉非尼也通过CRAF (RAF1)信号诱导野生型BRAF细胞的MAPK通路激活，这可能解释了在使用BRAF抑制剂治疗的患者中出现的鳞状细胞癌和角膜棘皮瘤。为了解决这个问题，我们发现，同时给药BRAF和MEK抑制剂可以消除细胞中BRAF抑制剂诱导的反常的MAPK信号，减少大鼠皮肤损伤的发生，并增强对小鼠模型中人类肿瘤异种移植瘤生长的抑制。综上所述，我们的研究结果为达拉非尼作为一种特异性、高效的BRAF抑制剂的概念提供了临床前证据，并为其与MEK抑制剂联合使用的潜在临床益处提供了证据。

　　braf激活突变已在许多癌症中被发现，是过度增殖的一个致病决定因素。RNA敲除和BRAF复合抑制可导致突变型BRAF肿瘤细胞周期阻滞和死亡，缓解了BRAF抑制剂用于治疗激活型BRAF驱动癌症的临床应用。

　　我们已经将达拉非尼 (泰菲乐)描述为一种选择性RAF激酶抑制剂，对来自多种物种的全长BRAF具有活性。虽然达拉非尼在体外抑制了一个被切断的CRAF激酶，但这并不能转化到细胞培养中，因为具有CRAF依赖的MEK激活(MEK抑制剂敏感)的细胞系对dabrafenib不敏感。酶学数据和细胞数据之间存在差异的原因尚不清楚，但可能归因于截短的(酶分析)CRAF相对于全长(细胞)CRAF具有更高的抑制剂敏感性。另外，可能存在修改CRAF构象的细胞因子，阻止其与达拉非尼结合。我们也不能排除细胞代偿机制的可能性，或上述所有因素的组合。我们演示了高选择性的达拉非尼BRAFV600E细胞系的80%测试和假设的相对缺乏活动(gIC50 > 2μM)对3 BRAFV600E细胞系可能是由于额外的突变的存在(GCT细胞中PTEN, PI3K在细胞,RKO和p53在A673细胞)，经内部排序。过度表达能够驱动细胞生长/存活的蛋白，或外排泵(s)的上调也可以从达非尼的抑制中拯救细胞生长。虽然达拉非尼敏感的BRAFV600E细胞系偶尔也编码其他突变，但我们认为BRAFV600E是这些细胞中的关键致癌驱动因子。我们证明了达拉非尼在酶和细胞水平上对激活的BRAFV600K和BRAFV600D突变体也有活性。最近的临床观察支持了这一观点，其中BRAFV600D/E/K肿瘤患者对GSK2118436 (达拉非尼)治疗有效。我们还观察到18个缺乏braf激活突变且含有野生型RAS的细胞系对达拉非尼的轻微敏感性(gIC50从263 nM到6.9μM)。虽然在这些细胞系之间没有发现常见的突变，但我们推测，激活上游BRAF驱动突变或过表达可能导致BRAF依赖的细胞增殖。此外，虽然达拉非尼具有很强的选择性，但我们不能排除可能导致达拉非尼敏感性的脱靶效应。

　　达拉非尼 (泰菲乐)对含有激活突变BRAF的细胞具有特异性活性。在BRAFV600E细胞中，达拉非尼以浓度依赖的方式抑制MEK和ERK的激活，同样具有低的nM活性。我们证实，在BRAFV600E细胞系(A375P)中，ARAF或CRAF敲低对MAPK激活没有影响。然而，达拉非尼抑制pMEK和pERK的方式与BRAF耗尽引起的类似，证实了达拉非尼的靶上机制，因为在BRAFV600E细胞中MAPK激活是BRAF依赖的。令人惊讶的是，ARAF或CRAF的缺失降低了达拉非尼对MAPK的抑制，这表明ARAF或CRAF的缺失可能会增加高活性BRAFV600E同源二聚体的形成，减少ARAF/BRAFV600E或CRAF/BRAFV600E异源二聚体的形成。另外，ARAF或CRAF耗尽可能导致负反馈回路的松弛。BRAF siRNA在第4和第7通道中观察到略低水平的MEK和ERK，而单独在第2通道中观察到达拉非尼没有，尽管它有诱导细胞死亡的能力。然而，细胞仅暴露达拉非尼1小时，这不足以通过凋亡降低完整蛋白含量，而siRNA处理是72小时。总之，这些数据清楚地支持了达拉非尼对癌细胞中激活的突变型BRAF的特异性细胞选择性。

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