FLT3 激活环突变体对雷德帕斯/米哚妥林的敏感性

　　靶向 fms 样酪氨酸激酶 3 (FLT3) 激活突变的小分子抑制剂在治疗白血病方面具有潜力。然而，某些突变可以同时激活酪氨酸激酶，并赋予对小分子抑制剂的抗性。因此，我们测试了 8 个 FLT3 激活环突变体对雷德帕斯（米哚妥林）的敏感性。每个突变体都赋予 Ba/F3 细胞不依赖于 IL-3 因子的增殖，并且每个突变体都导致 FLT3 及其靶标、信号转导和转录激活因子 5 (STAT5) 和细胞外刺激响应激酶 (ERK) 的组成型激活。对于每个测试的突变体，雷德帕斯抑制细胞生长和 FLT3、STAT5 和 ERK 的磷酸化。相比之下，雷德帕斯（米哚妥林）不抑制通过 FLT3 内部串联重复稳定转导的 Ba/F3 细胞，其中包含 G697R 突变，该突变赋予对雷德帕斯的抗性，表明雷德帕斯对 FLT3 激活环突变体的抑制不是由于脱靶效应。我们得出结论，雷德帕斯是一系列 FLT3 激活环突变的有效抑制剂，并且具有此类突变的急性髓系白血病患者是涉及雷德帕斯（米哚妥林）的临床试验的潜在候选者。

　　Fms 样酪氨酸激酶 3 (FLT3) 是一种细胞表面受体酪氨酸激酶，是急性髓系白血病 (AML) 中最常见的突变基因之一。刺激 FLT3 激活信号转导通路，如信号转导和转录激活因子 5 (STAT5)、RAS/丝裂原活化蛋白激酶 (RAS/MAPK)、磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K)、src 同源和胶原基因 (SHC) 、含 SH2 的肌醇 5-磷酸酶 (SHIP) 和具有 2 个 Src 同源性 2 (SH2) 结构域 (SHP2) 的细胞质酪氨酸磷酸酶，它们在细胞增殖、分化和存活中起重要作用。

　　在白血病患者中描述了两种类型的FLT3激活突变。这些包括发生在自抑制近膜结构域内的一系列内部串联重复 (ITD)和激活环突变，包括 Asp835Tyr (D835Y)、Asp835Val (D835V)、Asp835His (D835H)、Asp835Glu (D835E)、Asp835Ala (D835A)、Asp835Asn (D835N)、缺失和缺失。这些激活突变导致 FLT3 的组成型磷酸化和激活，以及下游靶标的后续激活。

　　FLT3突变在白血病发病机制中的重要性已得到充分证实，并且在大多数研究中，这些突变已被证明会导致预后不良，存活率降低。因此，注意力集中在开发针对 FLT3 的小分子抑制剂。雷德帕斯（米哚妥林）是 FLT3、血管内皮生长因子受体 (VEGFR)、血小板衍生生长因子受体 (PDGFR)、c-kit 受体酪氨酸激酶 (KIT) 和成纤维细胞生长受体的选择性抑制剂1 (FGFR-1)。在体外，雷德帕斯（米哚妥林）诱导 Ba/F3 细胞凋亡，这些细胞已被FLT3-ITD转化为不依赖 IL-3 的生长。此外，雷德帕斯（米哚妥林）在小鼠骨髓移植模型中对FLT3-ITD 诱导的疾病有效。

　　雷德帕斯（米哚妥林）已在 1 期和 2 期研究中进行了研究，通常耐受性良好。在复发或难治性 AML 患者的 2 期研究中，单药雷德帕斯（米哚妥林）导致外周血和骨髓原始细胞显着减少，反应率为 35%。雷德帕斯（米哚妥林）在与柔红霉素和阿糖胞苷联合治疗新诊断 AML 的 1 期试验中也显示出活性，尤其是那些具有FLT3-ITD 突变的患者。基于这些有希望的发现，计划进行一项随机 3 期癌症和白血病 B 组（CALGB）/西南肿瘤组（SWOG）/东部肿瘤合作组（ECOG）组间试验，以评估雷德帕斯（米哚妥林）诱导化疗对突变型患者的疗效。FLT3。

　　研究分析了 FLT3 激活突变对小分子抑制剂的敏感性，并证明某些激活环突变同时激活激酶并赋予对小分子抑制剂的抗性。因此，定义 FLT3 激活环突变范围对特定激酶抑制剂的精确敏感性谱对于确定患者是否适合治疗和评估治疗反应至关重要。在这里，我们报告说，雷德帕斯（米哚妥林）是一种有效的 8 种激活环突变抑制剂。

　　我们证实，每个激活环突变都会导致 FLT3 及其下游效应子 STAT5 和 ERK 的组成型激活。此外，用 STAT5 和 ERK 的磷酸化特异性抗体印迹也证明了这些活化 FLT3 靶标的组成型激活。

　　然后测试每个转导的 Ba/F3 细胞系对雷德帕斯（米哚妥林）的敏感性。表达每个激活环突变以及FLT3-ITD 的Ba/F3 细胞与不同浓度的雷德帕斯（米哚妥林）孵育。在 48 小时后，使用比色测定法对活细胞进行定量。随着midostaurin浓度的增加，所有细胞系的生长都受到抑制。IL-3 的加入取消了对生长的抑制，支持雷德帕斯（米哚妥林）的抑制作用对 FLT3 通路具有特异性。对于所有测试的突变体，抑制反应 50% (IC50)的细胞浓度小于 10 nM，范围为 1 nM 至 10 nM（表 S1，可在血液网站上获得；参见补充材料链接：在线文章的顶部），证明雷德帕斯（米哚妥林）在相对低的浓度下导致所有Ba/F3 构建体的细胞增殖减少。雷德帕斯（米哚妥林）的 1 期和 2 期试验的药代动力学研究表明，这些值应该在患者中很容易实现。

　　为了评估雷德帕斯（米哚妥林）对FLT3磷酸化的影响，从用不同浓度雷德帕斯（米哚妥林）孵育的细胞制备裂解物，然后用抗磷酸-FLT3抗体进行免疫印迹。在相对低浓度的雷德帕斯（米哚妥林）下，所有激活环突变体都抑制了FLT3 磷酸化。磷酸化抑制的 IC50与观察到的细胞生长抑制相当。我们还观察到 STAT5 和 ERK 的磷酸化在相对低浓度的雷德帕斯（米哚妥林）下受到抑制。

　　因此，所有测试的激活环突变体都对雷德帕斯（米哚妥林）的抑制敏感。然而，已知雷德帕斯（米哚妥林）抑制除FLT3 以外的激酶，因此观察到的结果，虽然与作为雷德帕斯（米哚妥林）靶点的FLT3 一致，但可以通过同时抑制细胞生长所必需的其他激酶来解释。为了证明米哚妥林的效果是完全可归因于抑制FLT3的，而不是由于脱靶效应，我们使用的Ba /重复实验F3细胞与稳定转导的FLT3-ITD G697R等位基因（BA / F3 FLT3-ITD- G697R 细胞），我们之前报道过它可以赋予对雷德帕斯（米哚妥林）的抗性。在细胞生长试验中，在高达 300 nM 的雷德帕斯（米哚妥林）剂量下没有抑制细胞增殖。此外，免疫印迹分析证明雷德帕斯（米哚妥林）不抑制 Ba/F3 FLT3-ITD-G697R 细胞中 FLT3、STAT5 或 ERK 的磷酸化。这些发现表明，在该细胞环境中对相应突变体FLT3激活等位基因的抑制是由于雷德帕斯（米哚妥林）对 FLT3 的特异性抑制。

　　这些发现与目前正在计划在组间环境中使用雷德帕斯（米哚妥林）和诱导化疗治疗新诊断的具有FLT3-ITD 突变的AML 患者的 3 期试验有直接关系。与其他小分子 FLT3 抑制剂相比，雷德帕斯（米哚妥林）可抑制全谱FLT3激活环突变。因此，这些数据表明，除了具有FLT3-ITD 等位基因的AML 患者外，还应考虑将FLT3 中具有此类激活环突变的 AML 患者作为入组候选者。微信扫描下方二维码了解更多：