MAPK/ERK激酶MEK是一种常见的癌症驱动因子KRAS和BRAF的共同效应因子，长期以来，在肿瘤学和最近的免疫治疗中，KRAS和BRAF被作为药物靶点。然而，许多MEK抑制剂(MEKi)由于靶向毒性和耐药性而受到限制。因此，从分子上了解MEK在生理复合物中的结构和功能，可以为设计更安全、更有效的治疗方案提供模板。在这里，我们报道了MEK与各种MEKi包括临床药物曲美替尼（trametinib）支架KSR (Ras激酶抑制子)结合的x射线晶体结构。这些结构揭示了一种意想不到的结合模式，曲美替尼在MEK界面上直接与KSR结合。通过络合作用，KSR重塑了原型的MEKi变构口袋，从而影响了结合和动力学，包括药物停留时间。此外，曲美替尼结合KSR-MEK，但通过一种利用进化上保守的界面残基来区分这些亚复合物的机制，破坏了相关的RAF-MEK复合物。基于这些发现，我们创造了trametiglue，它通过增强界面结合来限制对MEKi的适应性抗性。总之，我们的结果揭示了MEK亚复合物中界面口袋的可塑性，这对下一代靶向RAS通路药物的设计具有启示意义。
缺乏临床批准药物的配体-靶标复合物的结构数据变得越来越罕见。虽然我们也无法获得分离的MEK1与曲美替尼的共晶体，但当在与人KSR1或KSR2的复合物中纯化时，我们能够分别确定曲美替尼与KSR1:MEK1和KSR2:MEK1复合物结合的3.3 Å和2.8 Å结构。在曲美替尼结合的结构中，该化合物占据了atp19,20附近典型的MEKi变结构位，这与曲美替尼作为ATP非竞争性激酶抑制剂的特性一致。然而，曲美替尼还涉及一个扩展子口袋，达到KSR交互界面。
总体而言，曲美替尼（trametinib）可细分为3个药效团。A段包括2-氟、4-碘取代苯基，夹在MEK1的gatekeeper Met143、亚结构域II的保守赖氨酸(Lys97)和螺旋αC (Leu118)的c端和β-链4 (Val127, F129)的开始的几个疏水残基之间。第二B段位于激活段的n端一端，包括从Asp208开始的DFG基序。这部分抑制剂还生成了与Ser212主酰胺的氢键，这也是其他几个MEKi22的关键。B段的另一侧，包括环丙基环，紧挨着ATP的磷酸盐。曲美替尼的独特部分，没有在任何其他临床MEK抑制剂中发现，包括3-取代苯乙酰胺组，我们将其称为c节。曲美他尼位于MEK和KSR界面形成的口袋中，通过与HRD motif的310螺旋、Leu215、Ile216和Met219、Arg189和Asp190直接相互作用，接触点包括MEK的激活段。一个位于活化段末端的乙酰酰胺- arg234盐桥，以及KSR1和KSR2中分别来自前α g环的Ala825和Pro878的KSR。在秀丽隐杆线虫KSR -123中，KSR的前螺旋αG环与RASG12V抑制等位基因P696L的致癌信号有关，这一区域的功能重要性得到了强调。从晶体结构来看，曲美替尼（trametinib）的结合囊部分是通过KSR:MEK相互作用界面形成的。
为了更好地理解曲美替尼（trametinib）的独特性质，我们还求解了KSR2:MEK1和KSR1:MEK1结合cobimetinib(分别为2.99 Å和3.10 Å)、selumetinib(分别为3.09 Å和3.21 Å)和PD0325901(分别为3.19 Å和3.63 Å)的结构。与曲美替尼不同，KSR1和KSR2并不直接与我们分析的其他MEKi配体相互作用，这表明KSR的直接参与是曲美替尼的一个独特特征。事实上，尽管曲美替尼的末端-CH3基团与KSR1或KSR2的键合距离为~ 3Å，但我们分析的另一个MEKi与KSR:MEK相互作用界面的直接接触距离高达10Å。
与单独的MEK1相比，当MEK1与KSR1/2复合时，MEKi口袋的形状和大小有所不同。不像孤立的MEK1绑定到PD0325901 (PDB代码:3VVH)、selumetinib (4U7Z)和cobimetinib (4LMN)， MEK1在激活环的n端末端、310-螺旋和Ser218-Ser222位点上显示了显著的结构差异，因为这些基元在与KSR络合时延伸到距离MEK1活性位点~9Å的地方。激活环构像的巨大变化，以及伴随的MEKi变构囊的大小增加，通过KSR上的前螺旋αG环以及MEK1和KSR1或KSR2之间共享的独特反平行β片的形成而稳定下来。针对KSR1:MEK1，激活段内的3-残基反平行β-片结构在与曲美替尼配合后延伸为4-残基延伸((DD-E))。这种结构变化发生在MEK1中连接关键磷酸化调控位点S218和S222的片段上，产生了一个进一步扩大的口袋，以便容纳曲美替尼（trametinib）中的苯基乙酰胺基团。在KSR2:MEK1中没有发生同样的重排，因为无论MEKi是否参与，反平行激活片段都采用扩展的六残基片。KSR1与KSR2也有不同之处，它有独特的螺旋延伸(αG’)，并且在几个基元处。
接下来，我们对用不同MEKi预处理的细胞进行洗脱实验，然后添加trambo。在这些实验中，由荧光示踪剂随时间的结合所测量的BRET累积曲线的速度，与游离配体的解离和细胞内停留时间成正比24。在高于或接近IC50值的MEKi浓度范围内，我们观察到MEKi在MEK1-luc和KSR1-luc上的不同解离动力学。曲美替尼（trametinib）在KSR1-luc上的175分钟时间过程中显示了最慢的解离动力学，没有可检测到的BRET信号恢复。在不同的抑制剂浓度范围内，MEK1-luc较少；MEK1-luc和KSR1共表达也可以观察到这一点。相比之下，cobimetinib更容易从MEK1-luc和KSR1-luc解离，尽管相对于曲美替尼复合物的IC50值相似。这一数据表明，在洗脱实验的非平衡条件下，某些MEKi与ksr结合的MEK在较长时间内相互作用，洗脱实验可能模拟靶点占用和药理学，通常在体内观察到的动态条件下。
我们的比较分析显示，曲美替尼（trametinib）是一种“颠簸”的MEKi，通过与相关RAF亚家族激酶相关的ksr -家族伪激酶中发现的一个保守的“孔”使其能够结合。据我们所知，曲美替尼靶向KSR-MEK复合物是自然凹凸孔系统的第一个例子，通过重叠结合伙伴重塑药物结合位点。鉴于酶/假酶配对的普遍存在，更多的机会来开发自然凹凸和孔系统可能存在，但尚未被发现。此外，我们的研究强调了KSR是临床MEK抑制剂作用机制中缺失的关键部分。以具有分子胶样特征的化合物靶向MEK亚群，为选择性拮抗RAS驱动的恶性肿瘤患者提供了一条新的治疗途径。事实上，trametiglue的发现提供了一个框架，通过合理设计下一代靶向MAPK级联中重要调控复合物的界面结合区域的药物，克服当前可用MEKi的局限性。微信扫描下方二维码了解更多：
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