达拉非尼(dabrafenib)耐药后的表型特征

　　在本研究中，研究了对达拉非尼（dabrafenib）（一种 B-RAF 抑制剂）耐药的黑色素瘤细胞的表型，以进一步了解黑色素瘤对 B-RAF 抑制的耐药性。使用 3 种不同的细胞系 A375、397 和 624.38 产生对达拉非尼具有抗性的黑色素瘤细胞，所有细胞系均携带 B-RAFV600E，并通过细胞荧光分析、Ion Torrent 技术、免疫荧光和生物化学进行表征。所有 dabrafenib 耐药细胞除了 MAPK 信号的重新激活外，还表现出与其敏感对应物相比的形态变化，伴随着 CD90（间充质标记）表达的增加和 E-钙粘蛋白（上皮标记）表达的减少，表明上皮-间充质样表型转变。然而，与非 TGF-β1 诱导的 EMT 黑色素瘤细胞中观察到的敏感性相比，具有 TGF-β1 诱导的上皮间质转化 (EMT) 的黑色素瘤细胞对达拉非尼治疗更敏感，这表明 TGF-β1 诱导的EMT 与达拉非尼耐药无关。尽管达拉非尼（dabrafenib） 抗性细胞表现出增加的细胞运动和 E-cadherin/波形蛋白重组，正如在 EMT 中所预期的那样，但所有这些细胞都显示出不变的 E-cadherin mRNA 和不变的 Snail 蛋白水平，而 Twist1 蛋白表达降低，除了 A375 dabrafenib-抗性黑色素瘤细胞，在那里它不受影响。这些发现表明黑色素瘤细胞在药物暴露下采用了一种独特的活性 EMT 样过程。此外，达拉非尼（dabrafenib）抗性细胞表现出干细胞样特征，Oct4 从细胞质易位到核周位点和细胞核，并增加 CD20 表达。

　　黑色素瘤生物学知识的进步导致了所谓的“靶向疗法”的发展，例如分别针对 B-RAFV600E和 MEK 蛋白的达拉非尼和曲美替尼。然而，由于替代生长控制途径的激活而产生的耐药性仍然是用此类化合物治疗黑色素瘤的关键问题，尽管新兴的计算模型概念在预测治疗反应方面取得了长足进步。

　　在本研究中，我们观察到 3 种不同的黑色素瘤细胞系，均来自 MM 患者并携带 B-RAFV600E突变，含有一些能够在用达拉非尼 (B-RAFi) 治疗后增殖的细胞，表明黑色素瘤的存在能够逃避药物作用并负责黑色素瘤进展的细胞。我们发现所有 dabrafenib 抗性细胞都重新激活了 MAPK 信号传导，并且与药物敏感的对应物相比，呈现出更细长的形状，伪足形成和细胞间空间增加。值得注意的是，这些形态变化伴随着 CD90 表达的增加，CD90 是一种间充质标志物，E-钙粘蛋白（一种上皮标志物）的表达降低，表明耐达拉非尼的黑色素瘤细胞具有间充质特征。这一发现得到了在耐药细胞核周位点检测波形蛋白的进一步支持，而在对药物敏感的黑色素瘤细胞的细胞质中也观察到了波形蛋白。此外，所有耐达拉非尼的黑色素瘤细胞都显示出比对达拉非尼敏感的细胞更高的细胞运动性，表明这些细胞存在上皮-间充质表型转变。然而，被认为是真正的经典 EMT 诱导剂的 E-cadherin 的下调没有被检测到，表明黑色素瘤细胞经历了上皮-间充质样转变或病理性 EMT。这一发现得到了 TGF-β1 诱导的 EMT 与达拉非尼耐药性无关的观察结果的进一步支持。

　　此外，Ion Torrent 技术的序列分析表明，药物敏感和耐药黑色素瘤细胞之间主要癌基因的突变模式缺乏差异，表明所检查的致癌基因和抑癌基因的遗传改变不参与在耐药细胞中观察到的表型变化。

　　在过去的十年中，已经认识到发育性 EMT 过程在促进癌症侵袭和转移以及诱导耐药性方面发挥着关键和复杂的作用。据报道，参与 EMT 激活的基因，如 Wnt、Oct4、EGF 和 Nanog，在表现出干细胞特性的细胞中表达，并且 EMT 在乳腺癌的癌症干细胞 (CSC) 生成中起关键作用。我们研究了我们系列中 Oct4、CD20、CD133 和 CD44 干细胞标志物的表达。Oct4 是一种调控核心转录因子，参与维持间充质干细胞的干性。CD20 与黑色素瘤 CSCs 相关，而关于 CD133 作为黑色素瘤癌症干细胞标记物的不一致数据报道，并且尚未发现 CD44 与黑色素瘤干细胞相关。我们在达拉非尼耐药细胞和敏感细胞之间发现了不同的干细胞标记特征，这可以反映细胞来源的背景或微环境。值得注意的是，在核周位点和耐药细胞的细胞核中观察到 Oct4 的表达，而在对药物敏感的黑色素瘤细胞的细胞质中检测到它。

　　我们得出结论，黑色素瘤对达拉非尼（dabrafenib）的耐药性与 MAPK 信号重新激活相关，伴随着上皮-间充质样表型转变以及干细胞样表型特征的获得，这可能有助于解释细胞继续生存的能力在药物条件下增殖。

　　这些数据支持病理性 EMT 的概念以及将 EMT 过程与 CSC 生成联系起来的概念。了解与这种 EMT 样或病理性 EMT 相关的分子信号传导对于提供有效的靶向药物、成功的黑色素瘤治疗策略至关重要。因此，对该细胞亚群进行更详细的分子表征对于调节此类细胞程序以达到治疗目的可能至关重要。微信扫描下方二维码了解更多：