米哚妥林(midostaurin)联合强化化疗治疗下的克隆进化

　　在疾病抵抗或进展时，约 50% 接受米哚妥林（midostaurin）治疗的患者变为FLT3-ITD 阴性。FLT3-ITD持久性可以通过抗FLT3克隆，机制绕过FLT3抑制，或药物活性不足的选择所引起的。

　　在国际随机 3 期 RATIFY（60 岁以下患者的 FLT3 随机 AML 试验）试验中，多激酶抑制剂米哚妥林（midostaurin）显着提高了 18 至 59 岁FLT3突变型急性髓系白血病患者的总体和无事件生存率（反洗钱）。然而，midostaurin 组中只有 59% 的患者达到了方案指定的完全缓解 (CR)，几乎一半的患者达到了 CR 复发。为了探索耐药的潜在机制，我们研究了FLT3患者的克隆进化模式- 内部串联重复 (ITD) 阳性 AML，他们被纳入 RATIFY 或德国-奥地利急性髓系白血病研究组 16-10 试验并接受米哚妥林治疗。为此，使用传统的基于 Genescan 的FLT3-ITD测试和全外显子组测序分析了来自 54 名在诊断时和复发或难治性疾病时获得的配对样本。在疾病抵抗或进展时，几乎一半的患者（46%）变为FLT3-ITD 阴性，但在信号通路（例如 MAPK）中获得性突变，从而提供了新的增殖优势。在FLT3 的情况下- ITD 持久性，11% 发现抗性 ITD 克隆的选择是疾病的潜在驱动因素。在 32% 的病例中，未观察到FLT3-ITD 突变变化，这表明耐药机制绕过了 FLT3 抑制或由于药物水平不足而丧失了midostaurin 抑制活性。总之，我们的研究为FLT3-ITD 突变的 AML 在米哚妥林联合强化化疗治疗下的克隆进化和耐药机制提供了新的见解。

　　在FLT3突变的 AML 中，在强化标准治疗方案中加入米哚妥林（midostaurin）已广泛进入临床实践。因此，了解可能影响治疗结果的耐药机制非常重要。我们使用诊断性FLT3-ITD Genescan 分析和 WES研究了来自 54 名FLT3-ITD AML患者的配对样本，这些患者在与米哚妥林联合强化化疗后难治或复发。

　　我们研究的一个重要发现是，在 46% 的接受米哚妥林治疗的患者中，在复发或难治性疾病时不再检测到FLT3-ITD。由于数量少，FLT3-ITD 克隆的丢失仅在 21 名未接受米哚妥林的患者中有 4 名 (19%) 可见。尽管FLT3-ITD 被描述为疾病进展过程中相对不稳定的基因改变，但在接受米哚妥林治疗的患者中，FLT3-ITD 阴性病例数高于文献报道。另外，FLT3的中值 AR与用米哚妥林治疗的患者的 AR 相比，对照组复发时的 -ITDs 更高，表明米哚妥林抑制FLT3-ITD 克隆的扩增。有趣的是，几乎一半 (42%) 的难治性疾病患者也发现FLT3-ITD 缺失，这提供了证据表明许多患者在治疗的早期阶段就实现了FLT3-ITD 抑制，并且对治疗的抵抗是由其他因素驱动的。持续的突变。同样，我们最近表明，midostaurin 在第一个诱导周期结束时实现了最强的 FLT3 抑制（由最低水平的 FLT3 磷酸化水平表示）。这也在我们队列中具有可用 PIA 分析数据的 n = 12 名患者中观察到。

　　然而，必须谨慎解释FLT3-ITD 的缺失，因为基于 Genescan 的诊断检测（~5%）的敏感性相当低，该检测也在 RATIFY 和 AMLSG 16-10 试验中用作临床试验检测。尽管如此，我们的数据表明，在这些损失病例中，FLT3-ITD 亚克隆对联合治疗敏感，而其他突变则促进了疾病进展。我们在 11% 的接受米哚妥林（midostaurin）治疗的患者中检测到了新的FLT3- 在诊断时未检测到或在治疗期间扩增的 ITD 克隆。这种克隆进化模式仅在复发患者而非难治性疾病患者中发现，这支持了通过米哚妥林抑制进行克隆选择仅在长期暴露后发生的假设。

　　由于 RATIFY 和 AMLSG 16-10 试验中的许多患者因副作用而停止或减少米哚妥林治疗，因不依从或药代动力学不佳导致的药物水平不足也应视为治疗失败的原因。尽管我们的 PIA 分析在 12 个分析的患者样本中的 10 个中显示疾病进展时持续的 FLT3 抑制活性，但观察到抑制活性的高度可变性。这可以解释在某些情况下 FLT3 抑制不足，然后可能再次导致受抑制但持续存在的FLT3的产物-ITD 阳性克隆驱动疾病。在具有高抑制活性的情况下，这些数据也确实在功能上支持绕过正在进行的 FLT3 抑制的下游突变导致疾病进展。

　　FLT3基因中的点突变已被证明会导致对米哚妥林治疗产生抗性，在难治性疾病或复发患者中很少发现；在我们的研究中，只有 2 名患者获得了FLT3N676，尽管 VAF 较低（<5%），因此该突变不太可能是治疗抵抗的原因。

　　我们的结果与其他全基因组研究的结果一致，这些研究描述了疾病进展时突变的高度异质性，特别是在使用基于化疗的方案或 TKI治疗期间FLT3-ITD 阳性 AML 中。值得注意的是，我们研究中的所有患者在诊断和难治性或复发性疾病之间共有至少 1 个突变，这表明在疾病进展过程中存在一个共同的祖先白血病克隆。尽管突变具有很大的异质性，但我们的分析确定了几个在疾病进展时富集的基因，包括WT1、NRAS、KRAS和IDH1，以前与对化疗和米哚妥林治疗的抗性有关。我们还观察到与染色质粘连蛋白/剪接相关的基因（ASXL1、U2AF1、ZBTB7A和SF3B1）在耐药时发生突变。

　　总之，在我们接受米哚妥林（midostaurin）治疗的FLT3-ITD 突变 AML患者队列中，未再次发现FLT3 中的靶向突变作为疾病进展的潜在驱动因素，而几乎一半的患者丢失了FLT3-ITD 突变。WES 揭示了在诊断和疾病进展之间持续存在或获得的突变的高度异质性，通路富集分析指出复发时FLT3-ITD 丢失的患者存在异常的 MAPK 信号传导。据此，最近的一项靶向下一代测序研究确定了在 gilteritinib 治疗中疾病进展的 AML 中激活 RAS/MAPK 通路信号的突变，而继发性耐药突变如FLT3-F691 的检测频率也较低。从长远来看，更全面的单细胞靶向 DNA 测序将提供对 AML 中 TKI 治疗反应和耐药性克隆选择和进化的动态和复杂变化的更多见解。最终，对这些机制的深入理解可用于更好地监测治疗反应和耐药亚克隆的选择，也为FLT3-ITD 突变 AML 的个性化联合治疗方法提供基础。

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